La ricerca effettuata dagli autori è stata sostenuta in parte da sovvenzioni dall'Unione europea settimo programma quadro (FP7/2007-2013) sotto Grant accordo n. 229239 e dalla Fondazione AO, esplorativo ricerca collaborativa ricerca programma acuta Cartilagine ferita/lesione/difetto (CRP ACI) nell'ambito del progetto Bioactive e biomimetici scaffold per la rigenerazione della cartilagine (BIOCART).

1. auto-assemblanti Peptide impalcatura (SAPS) preparazione
<ol><li>Preparare una soluzione di 0,5% di peptide RAD16-I nel saccarosio 20% (p/v), in una provetta da centrifuga micro. Sonicare la soluzione del peptide per 20 min in un bagno ad ultrasuoni a potenza massima e a temperatura ambiente (TA) per garantire la miscelazione omogenea. Nota: Il volume della soluzione di essere preparati dipenderà il numero di incapsulamenti desiderato. RAD16-I peptidi non subiscono degradazione in queste condizioni di sonicazione.</li>
	<li>Diluire la soluzione di peptide preparata al punto 1.1 con il volume necessario di saccarosio al 10% (p/v) per ottenere la concentrazione finale desiderata. Nota: Un fattore importante da prendere in considerazione è la regolazione della concentrazione del peptide iniziale poiché la rigidità di matrice finale dipenderà da questo parametro. Il RAD16-io soluzione peptide dovrebbe essere più concentrato rispetto alla concentrazione finale desiderata del costrutto 3D 2x. Normalmente, il finale RAD16-ho usati le concentrazioni nel peptide sono tra 0,15 – 0,5% (p/v).</li>
	<li>Inserire la micro-provetta contenente la soluzione del peptide in un bagno ad ultrasuoni a RT per 20 min per garantire la miscelazione omogenea. Nota: Il peptide soluzione, se non utilizzato immediatamente, può essere conservata per diversi mesi a 4 ° C.</li>
</ol>2. preparazione della soluzione di cella
<ol><li>Centrifugare la sospensione cellulare (ottenuta dopo il trattamento di tripsina) a 60 x g e RT per 5 min.</li>
	<li>Rimuovere il surnatante con una pipetta di Pasteur collegata ad una linea del vuoto e sospendere il pellet cellulare in 3 – 5 mL di saccarosio al 10% (p/v) utilizzando una micropipetta. Procedere per contare le celle utilizzando un contatore di cellule manuale o automatico. Nota: La soluzione di saccarosio al 10% (p/v) è un mezzo isotonico e non ionici che permette per la manutenzione delle cellule ed evita la gelificazione del peptide durante il processo di miscelazione.</li>
	<li>Centrifugare la sospensione cellulare a 60 x g e RT per 5 min, rimuovere il supernatante e sospendere nuovamente il pellet cellulare nel volume necessario di saccarosio al 10% (p/v) per ottenere il doppio della concentrazione di cella finale desiderata (raccomandabile circa 4 x 106 cellule / mL).</li>
	<li>Inserire un numero desiderato di coltura del tessuto inserti in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti (un inserto per incapsulamento).</li>
	<li>Sonicare soluzione peptide preparata nel passaggio 1 alla massima potenza e RT per 5 min.</li>
	<li>Pipettare e posto 40 µ l della sospensione delle cellule (ottenuta in 2.3) per ogni incapsulamento desiderata più circa 10 – 15% del volume supplementare in un tubo di micro-centrifuga standard.</li>
</ol>3. 3D Cell incapsulamento in SAPS
<ol><li>Mescolare un volume uguale del RAD16-ho soluzione in saccarosio di 10% (w/v) (40 µ l per incapsulamento) con un volume uguale di sospensione delle cellule (40 µ l per incapsulamento) preparata nel passaggio 2 per ottenere una sospensione di cellule nella concentrazione del peptide desiderato (nel 10% di saccarosio). Mescolare pipettando lentamente su e giù per circa 10 volte. Evitare la formazione di bolle durante la miscelazione. Nota: Questo passaggio è fondamentale e deve essere eseguito con molta attenzione poiché le cellule sono in condizioni ostili a causa del peptide di basso pH (circa 3.5-4.0).</li>
	<li>Usando una micropipetta, accuratamente caricare 80 µ l della sospensione in ogni inserto.</li>
	<li>Aggiungere 0,5 mL di terreno di coltura per il fondo del pozzo per bagnare l'inserto della membrana, permettendo media diffusione promuovere l'auto-assemblaggio del peptide e hydrogel formazione. Lasciate che il peptide del gel per circa 20 min nell'armadietto di flusso. Nota: La manipolazione dei campioni durante l'impostazione di tempo potrebbe finire in gel di rottura.</li>
	<li>Molto lentamente aggiungere 40 µ l di terreno all'inserto e lasciarlo scivolare giù la parete interna al gel. Nota: Normalmente, il caricamento di questo volume dovrebbe prendere tra 20 – 30 s.</li>
	<li>Posizionare la piastra nell'incubatore (37 ° C, 5% CO2, atmosfera umidificata) per 20 min. Questo passaggio e aggiunte successive medie favorirà lisciviazione del saccarosio e l'equilibratura delle cellule con terreno di coltura.</li>
	<li>Aggiungere 60 µ l di terreno alla parete interna dell'inserto, facendolo fluire lungo la parete. Aspirare il mezzo del pozzo, che è ricco di saccarosio, e aggiungere 0,5 mL di terreno nuovo.</li>
	<li>Aggiungere 60 µ l di terreno lentamente all'inserto e posizionare la piastra nell'incubatore (37 ° C, 5% CO2, atmosfera umidificata) per 10 min.</li>
	<li>Aspirare il mezzo del pozzo e aggiungere 2,5 mL di terreno nuovo nel pozzo. Aggiungere 200 µ l di terreno nell'inserto. Posizionare la piastra nell'incubatore (37 ° C, 5% CO2, atmosfera umidificata) per mantenere le cellule in condizioni appropriate.</li>
	<li>Modificare il mezzo ogni giorno. Rimuovere il vecchio mezzo dal fondo del pozzo. Aggiungere 2,5 mL di terreno nuovo per il bene e 200 µ l per l'inserto. Nota: Se continua differenziazione cellulare, la media d'induzione specifico verrà aggiunto alle culture, conseguente l'impegno di tipo cellulare desiderato (Vedi sotto, differenziazione cellulare).</li>
</ol>4. attuabilità in 3D-SAPS
<ol> <li>Nota: L'analisi di attuabilità delle cellule è conosciuto come il Live/Dead — analisi di fattibilità/citotossicità pure.</li>
	<li>In una provetta da 15 mL, preparare il volume necessario di soluzione fresca di 2 µM calceina e 2 µM di omodimero di etidio-1 (EthD-1) in PBS nel Vortex per 10 s. tenga all'oscuro. Nota: Il volume da utilizzare per ogni campione dipenderà il ben formato secondo quanto segue: 2 mL per ciascun pozzetto di una piastra 6-pozzetti; 1 mL per ogni bene di una piastra 12-pozzetti e 0,5 mL per ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti.</li>
	<li>Usando una micropipetta, sciacquare i campioni 3D-SAPS 3 volte con 2 mL di PBS e poi, coprire con la soluzione preparata al punto 4.1. Incubare a temperatura ambiente per 40 min al buio.</li>
	<li>Utilizzando una micropipetta, sciacquare i costrutti con 2 mL di PBS 5 volte.</li>
	<li>Visualizzare i campioni sotto un microscopio di fluorescenza usando X 10 o 20 ingrandimenti.</li>
</ol>5. differenziamento
<ol><li>Cellule di cultura (37 ° C, 5% CO2, atmosfera umidificata) in condrociti basale medio (CBM) con crescita supplementi. Nota: La preparazione del mezzo è descritto nelle istruzioni del produttore (Vedi Materiali tavolo).</li>
	<li>Indurre la differenziazione delle cellule al giorno 2 con condrogenica contenenti medie ricombinanti umani trasformando il fattore di crescita-b1 [TGFb1] (10 ng/mL), acido L-ascorbico 2-fosfato [AA2P] (25 µ g/mL) e desametasone (100 nM).</li>
	<li>Mantenere la cultura per 4 settimane in un'incubatrice con atmosfera umidificata a 37 ° C e 5% CO2. Sostituire il terreno condrogenica ogni altro giorno.</li>
</ol>6. toluidina blu colorazione (TB)
<ol><li>Lavare le culture di 3D-SAPS due volte aggiungendo e rimuovendo quindi 2 mL di PBS con una micropipetta. Correggerli aggiungendo 2 mL di 2% (p/v) p-formaldeide in PBS per 2 h a TA.</li>
	<li>Lavare due volte con 2 mL di 0.1% Triton X-100 in PBS (PBST).</li>
	<li>Incubare con 2 mL di TB 0.05% in acqua per 20 minuti a TA.</li>
	<li>Lavare più volte (almeno 3 volte) con 2 mL di PBS, fino a quando la soluzione di PBS rimossa è chiara.</li>
	<li>Analizzare i campioni mediante ispezione visiva sotto un microscopio stereoscopico11,13,14. Nota: TB forma complessi con anionici glycoconjugates presso la matrice extracellulare, come proteoglicani (PG) e glicosaminoglicani (GAG), che sono principalmente secreto dai condrociti-come le cellule. Campioni positivi sono macchiati blu.</li>
</ol>7. Western Blot
Nota: La procedura utilizzata in questo protocollo è stata precedentemente descritta nel riferimento11.
<ol><li>Lyse 3D-costrutti in RIPA buffer contenente l'inibitore della proteasi cocktail di pipettaggio.</li>
	<li>Preparare il gel dell'acrilamide secondo requisiti di gel-volume (delle apparecchiature in esecuzione gel specifico) ed eseguire i lisati cellulari per 90 min a 150 V16. Nota: Gel dell'acrilamide è solitamente preparato ad una concentrazione di 7,5 – 10% (p/v), a seconda del peso molecolare della proteina.</li>
	<li>Trasferire le proteine contenute nel gel in una membrana di polivinilidene (PVDF) Il difluoruro applicando 40 V per 2 h a TA.</li>
	<li>Incubare la membrana PVDF a temperatura ambiente per 2 h in tampone bloccante (4% (p/v) di latte in polvere senza grassi in PBST) in un contenitore separato con volume sufficiente a coprire la membrana.</li>
	<li>Incubare la membrana a temperatura ambiente per 1 h con anticorpi primari ad una concentrazione finale di 1 mg/mL in PBST. Vedere la tabella dei materiali.</li>
	<li>Aggiungere gli anticorpi secondari ad una concentrazione di 1 mg/mL. Vedere la tabella dei materiali.</li>
	<li>Preparare la membrana per il rilevamento di hP con un substrato chemiluminescente16. Vedere la tabella dei materiali.</li>
	<li>Prendere immagini chemiluminescente16.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Aggeli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responsive+gels+formed+by+the+spontaneous+self-assembly+of+peptide+into+polymeric+&#946;-sheet+tapes.">Responsive gels formed by the spontaneous self-assembly of peptide into polymeric &#946;-sheet tapes.</a> Nature. 386, 259-262 (1997).</li><li>Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+we+build+artificial+stem+cell+compartments?.">Can we build artificial stem cell compartments?.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 3, 164-169 (2003).</li><li>Kisiday, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembling+peptide+hydrogel+fosters+chondrocyte+extracellular+matrix+production+and+cell+division:+implications+for+cartilage+tissue+repair.">Self-assembling peptide hydrogel fosters chondrocyte extracellular matrix production and cell division: implications for cartilage tissue repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 99, 9996-10001 (2002).</li><li>Narmoneva, D. A., Vukmirovic, R., Davis, M. E., Kamm, R. D., Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+promote+cardiac+myocyte+survival+and+spatial+reorganization:+implications+for+cardiac+regeneration.">Endothelial cells promote cardiac myocyte survival and spatial reorganization: implications for cardiac regeneration.</a> Circulation. 110, 962-968 (2004).</li><li>Genov&#233;, E., Shen, C., Zhang, S., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+functionalized+self-assembling+peptide+scaffolds+on+human+aortic+endothelial+cell+function.">The effect of functionalized self-assembling peptide scaffolds on human aortic endothelial cell function.</a> Biomaterials. 26, 3341-3351 (2005).</li><li>Garreta, E., Genov&#233;, E., Borr&#243;s, S., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteogenic+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells+and+mouse+embryonic+fibroblasts+in+a+three-dimensional+self-assembling+peptide+scaffold.">Osteogenic differentiation of mouse embryonic stem cells and mouse embryonic fibroblasts in a three-dimensional self-assembling peptide scaffold.</a> Tissue Engineering. 12, 2215-2228 (2006).</li><li>Sieminski, A. L., Semino, C. E., Gong, H., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+sequence+of+ionic+self-assembling+peptide+gels+affects+endothelial+cell+adhesion+and+capillary+morphogenesis.">Primary sequence of ionic self-assembling peptide gels affects endothelial cell adhesion and capillary morphogenesis.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 87 (2), 494-504 (2008).</li><li>Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembling+peptides:+from+bio-inspired+materials+to+bone+regeneration.">Self-assembling peptides: from bio-inspired materials to bone regeneration.</a> Journal of Dental Research. 87 (2008), 606-616 (2008).</li><li>Hern&#225;ndez Vera, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interstitial+fluid+flow+intensity+modulates+endothelial+sprouting+in+restricted+Src-activated+cell+clusters+during+capillary+morphogenesis.">Interstitial fluid flow intensity modulates endothelial sprouting in restricted Src-activated cell clusters during capillary morphogenesis.</a> Tissue Engineering Part A. 15 (1), 175-185 (2009).</li><li>Castells-Sala, C., Mart&#237;nez-Ramos, C., Vall&#233;s-Lluch, A., Monle&#243;n Pradas, M., Semino, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+development+of+bioimplants+made+up+of+elastomeric+scaffolds+with+peptide+gel+filling+seeded+with+human+subcutaneous+adipose+tissue-derived+progenitor+cells.">In vitro development of bioimplants made up of elastomeric scaffolds with peptide gel filling seeded with human subcutaneous adipose tissue-derived progenitor cells.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (11), 3419-3430 (2015).</li><li>Recha-Sancho, L., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparin-based+self-assembling+peptide+scaffold+reestablish+chondrogenic+phenotype+of+expanded+de-differentiated+human+chondrocytes.">Heparin-based self-assembling peptide scaffold reestablish chondrogenic phenotype of expanded de-differentiated human chondrocytes.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (7), 1694-1706 (2016).</li><li>Bussmann, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrogenic+potential+of+human+dermal+fibroblasts+in+a+contractile,+soft,+self-assembling,+peptide+hydrogel.">Chondrogenic potential of human dermal fibroblasts in a contractile, soft, self-assembling, peptide hydrogel.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 10 (2), E54-E62 (2016).</li><li>Recha-Sancho, L., Moutos, F. T., Abell&#224;, J., Guilak, F., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dedifferentiated+Human+Articular+Chondrocytes+Redifferentiate+to+a+Cartilage-Like+Tissue+Phenotype+in+a+Poly+(&#949;-Caprolactone)/Self-Assembling+Peptide+Composite+Scaffold.">Dedifferentiated Human Articular Chondrocytes Redifferentiate to a Cartilage-Like Tissue Phenotype in a Poly (&#949;-Caprolactone)/Self-Assembling Peptide Composite Scaffold.</a> Materials. 9 (6), 472 (2016).</li><li>Recha-Sancho, L., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondroitin+Sulfate+and+Decorin+based+self-assembling+scaffolds+for+cartilage+tissue+engineering.">Chondroitin Sulfate and Decorin based self-assembling scaffolds for cartilage tissue engineering.</a> PlosOne. 11 (6), e0157603 (2016).</li><li>Aloy-Revert&#233;, C., Moreno-Amador, J. L., Nacher, M., Montanya, E., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+RGD-Functionalized+Sandwich+Cultures+to+Promote+Redifferentiation+of+Human+Pancreatic+Beta+Cells+After+In+Vitro+Expansion.">Use of RGD-Functionalized Sandwich Cultures to Promote Redifferentiation of Human Pancreatic Beta Cells After In Vitro Expansion.</a> Tissue Engineering Part A. , (2017).</li><li>Kurien, B. T., Scofield, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+blotting+and+detection.">Protein blotting and detection.</a> Methods in Molecular Biology. 536, (2009).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

In precedenza, il nostro gruppo ed altri hanno descritto l'uso di piattaforme di tridimensionale (3D) cultura con cella diversi sistemi3,4,5,6,7,8 ,9,10,11,12,13,14,15. Nel lavoro attuale, descriviamo un metodo facile e affidabile di ottenere cultura 3D sistemi che sono applicabili a qualsiasi tipo di cellule di mammiferi tra cui qualsiasi tipo di cellula funzionale, embrionale o adulto cellule staminali, o alla fine, le cellule disfunzionali isolate da le biopsie o tumori e così via. Inoltre, in modo indipendente, se le cellule staminali sono di origine embrionale o adulto avrebbero una migliore capacità di impegno di lignaggio nell'ambiente 3D che in 2D classica cultura piatti10,11,12, 13,14,15. Di conseguenza, la coltura delle cellule in questo sistema porterebbe alla differenziazione in funzionale tessuto-come le strutture che potrebbero essere utilizzate in svariate applicazioni, dalla biomedicina riparativa o rigenerativa per piattaforme tossicologiche e farmacologiche.
Abbiamo dimostrato un chiaro aumento nella funzione delle cellule perché il microambiente cellulare è simile a quella dei tessuti naturali in termini di struttura matrix e parametri biomeccanici, biofisici e biologici. Tuttavia, come il sistema diventa più complesso, il numero di parametri che devono essere regolati anche aumenti, che comprende la necessità di una piattaforma di supporto esterna (ad esempio di un sistema di perfusione attiva per evitare problemi associati a fenomeni di trasferimento di massa ). Cellule coltivate tridimensionalmente le prestazioni migliori in termini che regolano le attività essenziali, quali la migrazione, proliferazione e differenziazione. Potrebbe formano reti complesse consentendo diafonia cellulare avanzata, che è di gran lunga una conseguenza essenziale di crescita e di differenziazione in 3D. Il fatto che i succhi potrebbe creare condizioni in vitro simile a quelle della matrice extracellulare proteine rappresenta un vantaggio poiché uno studio razionale dell'effetto prodotto per ogni componente aggiunto al patibolo (fattore di crescita, polisaccaride o segnalazione peptide) potrebbe essere facilmente portato.
I chiari vantaggi dell'uso di SAPS rispetto ad altri scaffold naturali, come collagene di tipo I e Matrigel, sono i seguenti: 1) SAPS è un biomateriale sintetico con minime variazioni da lotto a lotti di produzione; 2) SAPS ha la capacità di essere funzionalizzati con motivi di peptide specifico; e 3) presenta SAPS bassa biodegradabilità in vitro, che permette il mantenimento del costrutto 3D con le stesse proprietà biofisiche, biomeccaniche e strutturali nel corso del tempo. Tuttavia, la limitazione dell'utilizzo di SAPS contro altri ponteggi è trovato durante la fase di incapsulamento, dove le cellule sono in un ambiente ostile a causa del basso pH. Pertanto, questo è un passaggio fondamentale nella metodologia descritta. Inoltre, è importante impostare la concentrazione di SAPS per ciascun tipo di cella specifica prima di iniziare qualsiasi esperimento. Questo è, infatti, essenziale quando le cellule sono coltivate su o dentro questi biomateriali, poiché ogni tipo di cellula particolare presenterà condizioni di crescita ottimali biomeccanico.
Infine, riteniamo che la progettazione e la fabbricazione di questo tipo di ponteggio biomateriale potrebbe migliorare lo sviluppo di modelli 3D del tessuto più fisiologiche ed affidabili per aiutare l'industria farmaceutica a sviluppare migliori approcci terapeutici per medicina rigenerativa, cancro o qualsiasi trattamento medico.

Per molti decenni, coltura delle cellule dei mammiferi è stata eseguita in condizioni sperimentali, utilizzando sistemi di classica cultura bidimensionale (2D) a causa di problemi pratici ed economici indipendentemente gli aspetti non-fisiologica. Anche se questo sistema cultura aiuta a studiare e capire di più i meccanismi cellulari e molecolari, che conosciamo oggi sono necessari nuovi paradigmi di coltura delle cellule per studiare più complessi sistemi cellulari. Pertanto, sistemi tridimensionali (3D) cultura sono necessari per ricreare un microambiente che è biofisicamente, biomeccanico e biologicamente più simile a quella dei tessuti naturali. Negli ultimi anni, sistemi di coltura 3D, in generale, sono diventati più diffusi tra i ricercatori e l'industria rappresentano un nuovo modello di studio o di screening in cui le cellule possono crescere nello spazio, creare cellula--cellula o interazioni cellula-matrice, la migrazione e alla fine di differenziarsi in linee cellulari specifici.
L'obiettivo generale di questa metodologia è quello di ricreare un in vitro microambiente cellulare che è più vicino al microambiente in vivo . In particolare, lo scaffold sintetico di peptide autoassemblanti (SAPS) è un tipo di biomateriale con proprietà uniche; forma una rete di pori di dimensioni nanometriche fatto di interazioni deboli tra peptidi con proprietà meccaniche e strutturali simili quelli di matrici extracellulari naturale. In altre parole, la razionalità dietro l'uso di questo materiale è che crea un ambiente veramente 3D che è ideale per ottenere tessuti di pseudo-3D o unità di organo. Tuttavia, la cosa più importante, il contesto 3D permette di acquisire nuove funzioni biologiche che normalmente non sono presenti nelle piattaforme 2D cultura, come proprietà relazionati all'architettura dei tessuti, fenomeni di trasferimento di massa, cella patterning la struttura 3D e alla fine morfogenesi dei tessuti, che sono fattori chiave nella ricerca futura e nello sviluppo di tessuti funzionali e organi1,2. Inoltre, un vantaggio di SAPS sopra le loro controparti naturali (collagene, Matrigel) è che sono molto stabili a temperatura ambiente e non richiedono particolari condizioni di post-produzione, distribuzione o archiviazione3,4, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. SAPS è facile da gestire, quando lo si desidera; 3d gel può essere ottenuta semplicemente aumentando la forza ionica o regolando il pH a neutralità1,2. Infine, la metodologia descritta qui è stato ampiamente utilizzato in vitro per promuovere la manutenzione, la crescita e la differenziazione di un certo numero di tipi di cellule, tra cui gli epatociti, cellule endoteliali, osteoblasti, condrociti, cellule neuronali pure come cellule staminali embrionali e somatiche3,4,5,6,7,8,9,10, 11 , 12 , 13 , 14 , 15. nel lavoro attuale, descriviamo l'uso di un sistema 3D-cultura a differenziarsi chondrocytes articolari espanso umani (hACh) in cartilagine-come il tessuto come descritto in precedenza11.
Qui, è descritto un metodo per cellule di cultura in un sistema 3D utilizzando SAPS. In questo biomateriale sintetico, cellule prima sono mescolate con una soluzione di peptide, che è successivamente indotto di auto-assemblarsi, creando una rete di dimensioni nanometriche intorno alle cellule e quindi creare un ambiente veramente 3D (Figura 1). È importante considerare che il comportamento cellulare è interessato da valori di rigidezza di matrix (vale a dire, proliferazione, migrazione e differenziazione). Di conseguenza, un controllo metodologico comune è quello di cellule di cultura in cima l'impalcatura del peptide con gli stessi valori di rigidità (cultura su due dimensioni).

<table><tbody><tr><td>Human articular chondrocytes (Ach)</td><td>Lonza</td><td>CC-2550</td><td></td></tr><tr><td>RAD16-I peptide solution (PuraMatrix)</td><td>Corning</td><td>354250</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose (tissue culture grade)</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture inserts (0.4 &amp;micro;m pore, 12 mm diameter)</td><td>Millipore</td><td>PICM01250</td><td></td></tr><tr><td>Chondrocyte Basal Medium (CBM)</td><td>Lonza</td><td>CC-3217</td><td></td></tr><tr><td>SingleQuots of Growth Supplements</td><td>Lonza</td><td>CC-4409</td><td></td></tr><tr><td>Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit</td><td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Lonza</td><td>DE14-801F</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>Sigma</td><td>D8893</td><td></td></tr><tr><td>L-ascorbic acid 2-phosphate (AA2P)</td><td>Sigma</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>Human transforming growth factor-&amp;beta;1 (TGF-&amp;beta;1)</td><td>Millipore</td><td>GF111</td><td></td></tr><tr><td>RIPA buffer</td><td>Sigma</td><td>R0278</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Roche</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane</td><td>Invitrogen</td><td>LC 2005</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate</td><td>Thermo Scientific</td><td>34080</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Actin</td><td>SCBT</td><td>sc-1615</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Collagen I</td><td>Abcam</td><td>ab138492</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Collagen II</td><td>Abcam</td><td>ab3092</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Collagen X</td><td>Abcam</td><td>ab182563</td><td></td></tr><tr><td>Antigoat IgG-HRP</td><td>Abcam</td><td>ab97100</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse IgG-HRP</td><td>Abcam</td><td>ab97023</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rabbit IgG-HRP</td><td>Abcam</td><td>ab97051</td><td></td></tr></tbody></table>

culturing mammalian cells in three-dimensional peptide scaffolds

Una tecnica utile per la coltura di cellule in nanofibra autoassemblanti impalcatura tridimensionale (3D) è descritto. Questo sistema di coltura ricrea un ambiente che imita molto attentamente le caratteristiche strutturali del tessuto non polarizzato. Inoltre, la struttura particolare nanofibra intrinseco dell'impalcatura rende trasparente alla luce visibile, che consente una visualizzazione semplice del campione al microscopio. Questo vantaggio è stato ampiamente utilizzato per studiare la migrazione cellulare, organizzazione, proliferazione e differenziazione e così qualsiasi sviluppo della loro particolare funzione cellulare mediante colorazione con coloranti specifici o sonde. Inoltre, in questo lavoro descriviamo la buona prestazione di questo sistema per studiare facilmente la redifferentiation di espanso chondrocytes articolari umani in tessuto cartilaginoso. Cellule erano incapsulate in auto-assemblanti peptide impalcature e coltivate in condizioni specifiche per promuovere chondrogenesis. Le colture tridimensionali hanno mostrato buona redditività durante le 4 settimane dell'esperimento. Come previsto, campioni coltivati con induttori condrogenica (rispetto ai controlli non indotta) macchiato forte positivi per il blu di toluidina (che le macchie di glicosaminoglicani (gag) che sono altamente presenti nella matrice extracellulare della cartilagine) ed espresso marcatori molecolari specifici, tra cui collagene di tipo I, II e X, secondo analisi Western Blot. Questo protocollo è facile da eseguire e può essere utilizzato in laboratori di ricerca, industrie e per scopi didattici nei corsi di laboratorio.

Nel presente lavoro, un protocollo semplice e veloce alle cellule di cultura in 3D utilizzando SAPS è descritto per ottenere dati qualitativi e quantitativi affidabili. SAPS crea un microambiente 3D con proprietà uniche che permettono alle cellule coltivate in condizioni desiderate per procedere alla manutenzione delle cellule, proliferazione e/o differenziazione3,4,5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12. nel nostro gruppo, diversi studi sono stati effettuati utilizzando cellule di tessuto adiposo umano derivato progenitrici (hAPC), espanso chondrocytes articolari umani (hACh) e fibroblasti cutanei umani normali (hNDF) alla cultura, espandere e differenziarli in cartilagine-come il tessuto10,11,12. Qui, descriviamo la cultura 3D e la re-differenziazione di hACh espansa nel tessuto della cartilagine-come, come descritto in precedenza11. Quindi, abbiamo incapsulano le cellule in 3D-SAPS e cultura li in mezzo di induzione condrogenica, come descritto in Figura 1 (e nel protocollo). Dopo 24 h, i campioni sono stati valutati per la vitalità con le analisi di fattibilità/citotossicità Live/Dead. I risultati indicano che una piccola percentuale delle cellule erano morta (rosso) dopo 5 giorni di incapsulamento e quasi nessun cellule morte sono state osservate dopo 4 settimane di cultura (Figura 2). Successivamente, li abbiamo macchiato per la deposizione di glicosaminoglicani (GAG) presso la matrice extracellulare, utilizzando il metodo di colorazione blu di toluidina. Come previsto, il gruppo di induzione ha risposto correttamente al trattamento, mostrando forte colorazione (Figura 2).
Infine, marcatori molecolari degli indicatori Condrogenesi e ipertrofia, compreso il collagene di tipo I, II e X, sono stati analizzati mediante western blot (Figura 3). Collagene di tipo che i (COL1) stavo osservato nei sistemi 2D e 3D, ma una banda inferiore di ~ 130 kDa (che rappresentano le proteine trasformate di COL1 matura per essere assemblato presso la matrice extracellulare) è stato osservato solo in 3D. Questo risultato indica chiaramente che le cellule in fase di differenziazione in tre dimensioni procedere in modo più fisiologico. Notevolmente, collagene di tipo II (COL2) è stato rilevato - come una singola banda di peso molecolare previsto presente presso la matrice extracellulare - solo in 3D costrutti coltivate in condizioni di chondrogenic. Infine, collagene di tipo X (COL10) è stato rilevato nei costrutti sia 2D che 3D, coltivate in condizioni di chondrogenic, che indica un certo grado di ipertrofia dopo 4 settimane di cultura.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57259/57259fig1v2.jpg"> Figura 1: rappresentazione schematica di incapsulamento di cellule in 3D-SAPS. Rappresentazione schematica del incapsulamento hACh è descritto per ottenere cellule dislocate casualmente all'interno di 3D-SAPS. 1. auto-assemblanti preparazione del peptide dell'impalcatura (SAPS); 2. cella preparazione della sospensione; e 3. 3D-cell incapsulamento in SAPS. Si noti che lo schema elettrico Mostra solo passaggi 3.1-3.4.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57259/57259fig2.jpg"> Figura 2: differenziazione condrogenica e prestazioni nelle culture di 3D-SAPS cellulare. Macchiatura di attuabilità delle cellule eseguita a 5 giorni e 4 settimane di cultura rilevato sotto un microscopio a fluorescenza (cellule vive in cellule verde e morte in rosso). Scala bar = 200 µm. impegno generale chondrogenesis valutata dal blu di toluidina colorazione (i glycosaminoglycans solfonati in blu) di 3D-SAPS costrutti coltivate nei mezzi di controllo e chondrogenic. Scala bar = 500 µm. Questa figura è stata modificata da L. Recha-Sancho et al. 11. <a href="/files/ftp_upload/57259/57259fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57259/57259fig3.jpg"> Figura 3: collagene I, II e X espressione di hACh in fase di chondrogenesis. hACh coltivate in un monostrato di 2D e 3D-SAPS dopo 4 settimane in chondrogenic media e controlli sono stati valutati per l'espressione del collagene di tipo I (COL1), collagene di tipo II (COL2) e collagene di tipo X (COL10). Espressione dell'actina è stata utilizzata come controllo interno. Questa figura è stata modificata da L. Recha-Sancho et al. 11. <a href="/files/ftp_upload/57259/57259fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

Coltura di cellule di mammifero in scaffold tridimensionale Peptide

Qui, presentiamo un protocollo per ottenere sistemi 3D-cultura in auto-assemblanti peptide impalcature per promuovere la differenziazione dei chondrocytes articolari umani dedifferentiated in cartilagine-come il tessuto.

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.1K Views.  Ramon Llull University. Qui, presentiamo un protocollo per ottenere sistemi 3D-cultura in auto-assemblanti peptide impalcature per promuovere la differenziazione dei chondrocytes articolari umani dedifferentiated in cartilagine-come il tessuto.

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A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells within a tissue, however, are typically encased within a closely packed tissue mass in which cells establish intimate connections with many near-neighbors and with extracellular matrix components. Accordingly, the chemical milieu and physical forces experienced by cells within a 3D tissue are fundamentally different than those experienced by cells grown in monolayer culture. This has been shown to markedly impact cellular morphology and signaling. Several methods have been devised to generate 3D cell cultures including encapsulation of cells in collagen gels1or in biomaterial scaffolds2. Such methods, while useful, do not recapitulate the intimate direct cell-cell adhesion architecture found in normal tissues. Rather, they more closely approximate culture systems in which single cells are loosely dispersed within a 3D meshwork of ECM products. Here, we describe a simple method in which cells are placed in hanging drop culture and incubated under physiological conditions until they form true 3D spheroids in which cells are in direct contact with each other and with extracellular matrix components. The method requires no specialized equipment and can be adapted to include addition of any biological agent in very small quantities that may be of interest in elucidating effects on cell-cell or cell-ECM interaction. The method can also be used to co-culture two (or more) different cell populations so as to elucidate the role of cell-cell or cell-ECM interactions in specifying spatial relationships between cells. Cell-cell cohesion and cell-ECM adhesion are the cornerstones of studies of embryonic development, tumor-stromal cell interaction in malignant invasion, wound healing, and for applications to tissue engineering. This simple method will provide a means of generating tissue-like cellular aggregates for measurement of biomechanical properties or for molecular and biochemical analysis in a physiologically relevant model.

We describe a simple, rapid method of generating 3D tissue-like spheroids and their potential application to quantify differences in cell-cell interactions.

Un semplice Hanging goccia Cultura protocollo cellulare per la generazione di sferoidi 3D

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Ricerca

Bioingegneria

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

The influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally neuronal differentiation is of great interest in order to find new methods for cell-based and standardised therapies in neurological disorders or neurodegenerative diseases. 3D structures are expected to provide an environment much closer to the in vivo situation than 2D cultures. In the context of regenerative medicine, the combination of biomaterial scaffolds with neural stem and progenitor cells holds great promise as a therapeutic tool.1-5 Culture systems emulating a three dimensional environment have been shown to influence proliferation and differentiation in different types of stem and progenitor cells. Herein, the formation and functionalisation of the 3D-microenviroment is important to determine the survival and fate of the embedded cells.6-8 Here we used PuraMatrix9,10 (RADA16, PM), a peptide based hydrogel scaffold, which is well described and used to study the influence of a 3D-environment on different cell types.7,11-14 PuraMatrix can be customised easily and the synthetic fabrication of the nano-fibers provides a 3D-culture system of high reliability, which is in addition xeno-free.
Recently we have studied the influence of the PM-concentration on the formation of the scaffold.13 In this study the used concentrations of PM had a direct impact on the formation of the 3D-structure, which was demonstrated by atomic force microscopy. A subsequent analysis of the survival and differentiation of the hNPCs revealed an influence of the used concentrations of PM on the fate of the embedded cells. However, the analysis of survival or neuronal differentiation by means of immunofluorescence techniques posses some hurdles. To gain reliable data, one has to determine the total number of cells within a matrix to obtain the relative number of e.g. neuronal cells marked by &beta;III-tubulin. This prerequisites a technique to analyse the scaffolds in all 3-dimensions by a confocal microscope or a comparable technique like fluorescence microscopes able to take z-stacks of the specimen. Furthermore this kind of analysis is extremely time consuming. 
Here we demonstrate a method to release cells from the 3D-scaffolds for the later analysis e.g. by flow cytometry. In this protocol human neural progenitor cells (hNPCs) of the ReNcell VM cell line (Millipore USA) were cultured and differentiated in 3D-scaffolds consisting of PuraMatrix (PM) or PuraMatrix supplemented with laminin (PML). In our hands a PM-concentration of 0.25% was optimal for the cultivation of the cells13, however the concentration might be adapted to other cell types.12 The released cells can be used for e.g. immunocytochemical studies and subsequently analysed by flow cytometry. This speeds up the analysis and more over, the obtained data rest upon a wider base, improving the reliability of the data.

Here we describe the use of a self-assembling 3-dimensional scaffold to culture human neural progenitor cells. We present a protocol to release the cells from the scaffolds to be analysed subsequently e.g. by flow cytometry. This protocol might be adapted to other cell types to perform detailed mechanistically studies.

La coltivazione di cellule progenitrici neurali umane in un 3-dimensionale di auto-assemblaggio Peptide Hydrogel

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

Ponteggi self-reporting per coltura cellulare 3-Dimensional

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

Neuroblastoma is the most common extracranial solid tumor in children, accounting for 15% of overall pediatric cancer deaths. The native tumor tissue is a complex three-dimensional (3D) microenvironment involving layers of cancerous and non-cancerous cells surrounded by an extracellular matrix (ECM). The ECM provides physical and biological support and contributes to disease progression, patient prognosis, and therapeutic response.
This paper describes a protocol for assembling a 3D scaffold-based system to mimic the neuroblastoma microenvironment using neuroblastoma cell lines and collagen-based scaffolds. The scaffolds are supplemented with either nanohydroxyapatite (nHA) or glycosaminoglycans (GAGs), naturally found at high concentrations in the bone and bone marrow, the most common metastatic sites of neuroblastoma. The 3D porous structure of these scaffolds allows neuroblastoma cell attachment, proliferation and migration, and the formation of cell clusters. In this 3D matrix, the cell response to therapeutics is more reflective of the in vivo situation.
The scaffold-based culture system can maintain higher cell densities than conventional two-dimensional (2D) cell culture. Therefore, optimization protocols for initial seeding cell numbers are dependent on the desired experimental timeframes. The model is monitored by assessing cell growth via DNA quantification, cell viability via metabolic assays, and cell distribution within the scaffolds via histological staining.
This model&#39;s applications include the assessment of gene and protein expression profiles as well as cytotoxicity testing using conventional drugs and miRNAs. The 3D culture system allows for the precise manipulation of cell and ECM components, creating an environment more physiologically similar to native tumor tissue. Therefore, this 3D in vitro model will advance the understanding of the disease pathogenesis and improve the correlation between results obtained in vitro, in vivo in&#160;animal models, and human subjects.

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

This paper lists the steps required to seed neuroblastoma cell lines on previously described three-dimensional collagen-based scaffolds, maintain cell growth for a predetermined timeframe, and retrieve scaffolds for several cell growth and cell behavior analyses and downstream applications, adaptable to satisfy a range of experimental aims.

Modello biomimetico tridimensionale in vitro di neuroblastoma utilizzando scaffold a base di collagene

Neuroblastoma is the most common extracranial solid tumor in children, accounting for 15% of overall pediatric cancer deaths. The native tumor tissue is a ...

Ricerca sul cancro

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.

This manuscript describes a soft lithography-based technique to engineer uniform arrays of three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined geometry surrounded by extracellular matrix. This method is amenable to a wide variety of cell types and experimental contexts and allows for high-throughput screening of identical replicates.

Tessuti epiteliali Ingegneria tridimensionali integrati all&#39;interno di matrice extracellulare

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from brown sea algae. Briefly, the tumor tissue is cut into small pieces and submitted to an enzymatic digestion with collagenase and trypsin. Next, a cell suspension is obtained. The tumor cell suspension is mixed with 1.2% sodium alginate and dropped into a CaCl2 solution, and the alginate/cell suspension is gelled on contact with the CaCl2 to form spherical beads. The cells embedded in the alginate beads are supplied with nutrients provided by the culture media enriched with 20% FBS. Three-dimensional culture in alginate beads maintains the viability of adenoma cells for long periods of time, up to four months. Moreover, the cells can be liberated from the alginate by washing the beads with sodium citrate and seeded on glass coverslips for further immunocytochemical analyses. The use of a cell culture model allows for the fixation and visualization of the actin cytoskeleton with minimal disorganization. In summary, alginate beads provide a reliable culture system for the maintenance of pituitary adenoma cells.

Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.

Tridimensionale alginato-tallone coltura di cellule umane adenoma ipofisario

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Medicina

Controlling Particle Fraction in Microporous Annealed Particle Scaffolds for 3D Cell Culture

Microgels are the building blocks of microporous annealed particle (MAP) scaffolds, which serve as a platform for both in vitro cell culture and in vivo tissue repair. In these granular scaffolds, the innate porosity generated by the void space between microgels enables cell infiltration and migration. Controlling the void fraction and particle fraction is critical for MAP scaffold design, as porosity is a bioactive cue for cells. Spherical microgels can be generated on a microfluidic device for controlled size and shape and subsequently freeze-dried using methods that prevent fracturing of the polymer network. Upon rehydration, the lyophilized microgels lead to controlled particle fractions in MAP scaffolds. The implementation of these methods for microgel lyophilization has led to reproducible studies showing the effect of particle fraction on macromolecule diffusion and cell spreading. The following protocol will cover the fabrication, lyophilization, and rehydration of microgels for controlling particle fraction in MAP scaffolds, as well as annealing the microgels through bio-orthogonal crosslinking for 3D cell culture in vitro.

Minimizing the variability in the particle fraction within granular scaffolds facilitates reproducible experimentation. This work describes methods for generating granular scaffolds with controlled particle fractions for in vitro tissue engineering applications.

Controllo della frazione di particelle in scaffold di particelle ricotto microporose per colture cellulari 3D

Microgels are the building blocks of microporous annealed particle (MAP) scaffolds, which serve as a platform for both in vitro cell culture and in vivo ...

<meta charset="utf8"></head><body>Sistema avanzato di co-coltura 3D a due strati per cellule epiteliali e fibroblasti

Establishing a Three-Dimensional Coculture Module of Epithelial Cells Using Nanofibrous Membranes

Technical hurdles in a culture of epithelial cells include dedifferentiation and loss of function. Biomimetic three-dimensional (3D) cell culture methods can enhance cell culture efficiency. This study introduces an advanced two-layered culture system intended to cultivate epithelial cells as tissue-like layers with the culture of fibroblasts within a 3D environment. Polyvinyl alcohol (PVA) and poly(&#949;-caprolactone) (PCL) nanofibrous membranes (NMs) were fabricated via electrospinning and utilized as a physiologically relevant extracellular matrix for the culture of epithelial cells and fibroblasts, respectively. In the upper insert wells, lung epithelial cells were cultivated on the PVA NM, and in the lower chambers, fibroblasts were cultured on the PCL NM. This configuration eliminates direct cell-cell contact and facilitates the examination of paracrine signaling mediated by soluble factors. Confocal microscopy was employed to analyze the distribution, growth pattern, and expression of intracellular proteins, including zona occludens in epithelial cells. Z-stacking techniques enabled detailed 3D reconstructions, providing precise insights into the integrity of tight junctions and spatial organization within the epithelial layer. Scanning electron microscopy (SEM) assessed the morphological characteristics of cell types on the nanofibrous membranes. SEM imaging revealed intricate cell surface structures and interactions with the nanofibers, offering a comprehensive perspective on cellular architecture and cell interaction with nanofibrous structure. The Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay is a simple method for measuring epithelial cell and fibroblast growth rates over time. It provides the proliferative behaviors and potential synergistic effects of coculturing these cells. These findings highlight the effectiveness of a simple insert co-culture system for simultaneous culture of fibroblasts and epithelial cells, which is crucial in various physiological and pharmacological contexts, including epithelial tissue regeneration, tumor microenvironment with endothelial, immune, and other stroma cells, toxicity assay, and drug activity test.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Avanzamento dei sistemi di cocoltura 3D con membrane nanofibrose PVA-PCL

Here, we demonstrate how epithelial cells cultured with fibroblasts in the nanofibrous membrane-based two-layer system can stably adhere to and grow on the membrane.

Definizione di un modulo di cocoltura tridimensionale di cellule epiteliali utilizzando membrane nanofibrose

Technical hurdles in a culture of epithelial cells include dedifferentiation and loss of function. Biomimetic three-dimensional (3D) cell culture methods ...

Coltura di cellule di mammifero in scaffold tridimensionale Peptide

Riepilogo

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Un semplice Hanging goccia Cultura protocollo cellulare per la generazione di sferoidi 3D

La coltivazione di cellule progenitrici neurali umane in un 3-dimensionale di auto-assemblaggio Peptide Hydrogel

Ponteggi self-reporting per coltura cellulare 3-Dimensional

Modello biomimetico tridimensionale in vitro di neuroblastoma utilizzando scaffold a base di collagene

Tessuti epiteliali Ingegneria tridimensionali integrati all'interno di matrice extracellulare

Tridimensionale alginato-tallone coltura di cellule umane adenoma ipofisario

Controllo della frazione di particelle in scaffold di particelle ricotto microporose per colture cellulari 3D

Definizione di un modulo di cocoltura tridimensionale di cellule epiteliali utilizzando membrane nanofibrose

Definizione di un modulo di cocoltura tridimensionale di cellule epiteliali utilizzando membrane nanofibrose

Definizione di un modulo di cocoltura tridimensionale di cellule epiteliali utilizzando membrane nanofibrose