La principal contribución de nuestro artículo es que hemos explorado un paisaje preciso y fino de patología beta amiloide del cerebro de la enfermedad de Alzheimer con la tecnología de imagen de la espectrometría de masas por imágenes MALDI. Logramos avances tecnológicos mediante la generación de un protocolo especial con pretratamiento de ácido fórmico de los portaobjetos tisulares. Después de MALDI-IMS, se generan mapas de segmentación y se realizan cálculos para descubrir nuevas proteínas marcadoras o péptidos colocados con placa y vasculatura subaracnoidea.
Obtener especímenes corticales humanos para IMS de cerebros que fueron removidos, procesados y almacenados a menos 80 grados Celsius dentro de las ocho horas post-mortem. Tome el espécimen cerebral de la corteza occipital de los pacientes con AD y controles anticuados. Para cortar las secciones de tejido en un criostato, en primer lugar el óxido de estaño de indio conductor o el vidrio del microscopio recubierto de ITO se desliza dentro del criostato.
Caliente el espécimen cerebral de la autopsia de menos 80 grados Celsius a menos 22 grados Celsius dentro del criostato. Adjunte una nueva cuchilla desechable al criostato para cada experimento. Siempre trate de usar una parte limpia de la cuchilla.
Ponga los cerebros de la autopsia congelada en el escenario junto con una pequeña cantidad de compuesto óptimo de temperatura de corte. Para ims e inmunohistoquímica, corte de cinco a seis secciones de cada muestra de tejido. Cuando la hoja está empezando a cortar el tejido, gire la rueda y dé la cara al bloque hasta que todo el tejido quede expuesto.
Si hay una pequeña raya o desgarro en la sección, espere en el criostato hasta que el ajuste de temperatura lo arregle automáticamente. Cuente unos segundos antes de abrir el anti-roll con un tejido debajo. Coloque inmediatamente la rebanada de tejido en el lado recubierto de ITO del portaobjetos de vidrio.
Descongele la rebanada de tejido colocando un dedo debajo de la diapositiva en el lado no recubierto de ITO. El tejido se pegará a la diapositiva. Asegúrese de que el tejido sea lo más plano posible sin arrugas.
Para enjuagar las secciones de tejido, sumerja las muestras en 40 a 100 mililitros de 70%etanol en un frasco de tinción de vidrio durante 30 segundos para eliminar los lípidos endógenos y las sales inorgánicas. Lave las muestras utilizando la secuencia de lavado enumerada en el protocolo de texto. A continuación, seque las muestras al vacío durante 30 minutos.
Ahora, tratar las secciones del tejido con un vapor de ácido fórmico para una mejor ionización de las proteínas beta amiloide a partir del tejido cerebral de la autopsia. Para ello, preparar el horno a 60 grados centígrados y un plato de vidrio de incubación con cinco mililitros de ácido 100% formético. Mantenga la humedad del aire en el plato de vidrio de incubación a nivel de saturación.
Coloque los portaobjetos en el plato de vidrio de incubación mientras evita la inmersión en el ácido fórmico y tratar durante seis minutos. Tome una imagen óptica de las muestras utilizando un escáner de película fotográfica, un escáner de gel o un microscopio digital. Realice este paso a temperatura ambiente.
La alineación de la imagen óptica de las muestras es necesaria cuando el objetivo de la muestra se coloca dentro del instrumento. Por lo general, no será posible reconocer la sección de tejido debajo de la capa de matriz. Para correlacionar las imágenes ópticas con las muestras, haga marcas de guía que sean visibles tanto en la imagen óptica como debajo de la capa de matriz en la óptica de la cámara.
La forma más fácil es detectar al menos tres marcas de fluido de corrección alrededor de la muestra antes de tomar la imagen óptica. Para rociar la matriz con un pulverizador ultrasónico, retire el tejido que se va a rociar del desecador y colóquelo en la cámara. Asegúrese de que el tejido no cubra la ventana del sensor.
Inicie la preparación pulsando el botón Inicio. Por lo general, el tiempo de preparación es de alrededor de 90 minutos. La preparación se regulará automáticamente mediante el control del espesor y la humedad de la capa de matriz.
Alternativamente, para pulverizar la solución de matriz en la superficie del tejido con un pulverizador automático, utilice un sistema de bomba de disolvente establecido en 10 psi y 0,15 mililitros por minuto para entregar la solución de matriz. Un flujo constante de gas de vaina calentada se entregará conjuntamente con el spray de solución de matriz. Realice experimentos de imágenes de alto rendimiento y alta resolución espacial con MALDI-IMS.
Para la medición de espectrometría de masas, defina las áreas de tejido utilizando el software de control MALDI y el software de análisis de datos. Adquiera espectros en un modo lineal positivo con un rango de relación entre masa y carga de 2.000 a 20.000 y una resolución espacial de 20 y 100 micras. Para hacer el estándar de calibración, disuelva el estándar de calibración de péptidos y el estándar de calibración de proteínas en una proporción de uno a cuatro con la solución CHCA y TA30 y luego diluya 10 veces.
Coloque un microlitro de calibración estándar en la diapositiva en cuatro ubicaciones diferentes. Usando software de histología molecular, superponga múltiples imágenes de señal para encontrar la correlación espacial de varias señales tales como diferentes péptidos beta amiloidees colocando en placas seniles y paredes arteriales. La angiopatía amiloide cerebral o fenotipos CAA del paciente número tres fueron los más prominentes en este estudio.
MALDI-IMS del tejido cerebral de este paciente visualizó claramente que el amiloide beta 1-42 y el amiloide beta 1-43 fueron depositados preferentemente como placas seniles en el parénquima cerebral. Por el contrario, betas amiloide más cortas como el amiloide beta 1-36 a 1-41 se depositaron preferentemente en las áreas vasculares leptomeningeales. No hubo señales significativas en el control no patológico.
Las distribuciones de amiloide beta 1-40 y amiloide beta 1-42 se validaron aún más con inmunohistoquímica utilizando secciones congeladas adyacentes de los tejidos. El anticuerpo antiamimoides beta 1-40 etiquetado COMO AA y el amiloide beta 1-40 revelado se deposita preferentemente en los vasos sanguíneos leptomeningeales, lo que contrasta claramente con la distribución de amiloide beta 1-42 en el parénquima cerebral como placas seniles. Aquí se muestra un mapa de segmentación obtenido con un análisis k-means bisectriz aplicado a la misma sección del paciente número tres.
Este método de agrupamiento identificó con éxito estructuras similares a placas en el parénquima y estructuras vasculares en el espacio subaracnoideo. Es interesante encontrar una pequeña zona circular en el parénquima que se detecta justo alrededor de una pequeña arteriola en el parénquima, así como en el espacio subaracnoideo. Esto es verificado por imágenes de iones individuales de estos péptidos beta amiloide individuales.
Hay un límite para rastrear una amplia gama de betas amiloideas simultáneamente incluso si se utilizan los anticuerpos específicos. Aquí, mostramos la distribución de beta amiloide en cerebros humanos mediante el método de espectrometría de masas de imágenes MALDI de vanguardia. Creemos que esta contribución hace un avance en la investigación de la enfermedad de Alzheimer porque este informe ofrece la caracterización del conjunto completo de proteínas beta amiloideas en cerebros autopsiados humanos.
El hallazgo más impresionante es que sólo una sola alteración de aminoácidos en el terminal C de la proteína beta amiloide hace un cambio drástico en su distribución. Los pasos de preparación del tejido son críticos para obtener una ionización efectiva de las proteínas agregadas en el tejido cerebral humano. Cocrystallización homogénea del analito con matrices cruciales para la alta sensibilidad y la imagen sin artefactos.
