Las acciones de la Bloomington Drosophila Stock Center (NIH P40OD018637) fueron utilizadas en este estudio. La investigación en esta publicación fue apoyada por la red institucional desarrollo Award (IDeA) para la excelencia en la investigación biomédica desde el Instituto Nacional de General médica Ciencias de los institutos nacionales de salud, bajo el número de concesión P20GM103430 y por la Fundación de Rhode Island. Autores agradecen las aguas J. y correa Snodgrass P. por su apoyo en el desarrollo de este protocolo.

1. ensayo de preparación (día 1)
<ol><li>Coloque el analizador metabólico (Tabla de materiales) en una incubadora o un cuarto de control de temperatura a 11 ° C. Nota: Esta temperatura es ideal para las mediciones a 25 ° C, ya que permite la fluctuación de temperatura ~ 14 ° C que se produce mientras se ejecuta el ensayo. Esto es causado por el calor generado por el instrumento durante la ejecución.</li>
	<li>Abra el software apropiado en el ordenador conectado al analizador metabólico. Haga clic en la temperatura numérica en el lado izquierdo de la parte inferior de la pantalla. En la nueva ventana que se abre, haga clic en la casilla al lado del comando "Calentador" y aparece una marca de verificación. Ajustar la temperatura a 25 ° C y ajustar el rango de tolerancia de 0,2 ° C usando las flechas. Nota: Se requieren varias horas para lograr temperaturas estables.</li>
	<li>Abra el contenedor del cartucho (Tabla de materiales) y extraiga el cartucho de la placa de utilidad sin tocar las puntas de prueba. Nota: La placa de utilidad se utiliza durante el calibrado del cartucho y no se utiliza mientras se ejecuta el ensayo metabólico.</li>
	<li>Añadir 200 μL de una solución de calibrant (Tabla de materiales) a la placa de utilidad y coloque el cartucho nuevo encima de la placa de utilidad para rehidratar el sensor de las sondas en el cartucho. No toque las puntas de prueba y protegerlos de la luz.</li>
	<li>Sello del cartucho con la película de parafina.</li>
	<li>Incubar el cartucho durante la noche a 25 ° C.</li>
</ol>2. ensayo preparación de medios de comunicación (día 2)
<ol><li>Añadir 10 mM de glucosa y piruvato de sodio 10 mM al medio de ensayo.</li>
	<li>Incubar el medio a 25 ° C hasta que el líquido ha equilibrado a esta temperatura.</li>
	<li>Ajustar el pH a 7.4 con un medidor de pH.</li>
</ol>3. instalación del Software para el análisis metabólico de los cerebros de Drosophila melanogaster (día 2)
<ol><li>Configurar el software metabólico en el analizador metabólico utilizado en el paso 1.2.</li>
	<li>Seleccione "Plantilla" en la pantalla principal del software.</li>
	<li>Haga doble clic en "Espacio en blanco" para empezar un nuevo diseño de ensayo.</li>
	<li>Haga clic en el botón "Mapa de la placa" en la barra de herramientas superior para ver el diseño de la placa de ensayo de la célula. Nota: La placa de ensayo de célula contendrá las muestras de cerebro y será emparejada con el cartucho antes de comenzar la serie metabólica.</li>
	<li>
Haga clic en el añadir botón de grupos x 3.
	<ol>
<li>Haga doble clic en la etiqueta de "Grupo 1" y cámbiele el nombre a "Experimental". Nota: Este grupo contiene un cerebro de mosca y una restricción de micro tejidos tratados con fármacos.</li>
		<li>Haga doble clic en la etiqueta de "Grupo 2" y cámbiele el nombre a "Control". Nota: Este grupo contiene un cerebro de mosca y un micro-tejido de sujeción con ningún tratamiento farmacológico.</li>
		<li>Haga doble clic en el "Grupo 3" la etiqueta y cámbiele el nombre a "moderación sólo". Nota: Este grupo contiene una restricción de micro-tejido sin cerebros o tratamiento farmacológico.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Asignar los pozos a cada grupo en donde las muestras en la placa del celular vayan a colocarse.
	<ol>
<li>Haga clic en la etiqueta de "Experimental" y luego destacar pozos B2 - B8 en el mapa de la placa.</li>
		<li>Haga clic en la etiqueta de "Control" y luego destacar pozos C2-C8 en el mapa de la placa.</li>
		<li>Haga clic en la "etiqueta de seguridad única'' y pozos de resalte D2-D8 en el mapa de la placa.</li>
		<li>Compruebe que las cuatro esquinas (A1, A12, H1 y H12) se señalan como antecedentes. Nota: Los pozos a lo largo del perímetro de la placa no se utilizan para reducir los efectos de borde. Se trata de un defecto en el software.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Haga clic en el botón de "Protocolo" en la barra de herramientas superior para configurar el protocolo.
	<ol>
<li>Haga clic en el "datos de medición de edición" en la caja de medición de línea de base.</li>
		<li>Ajustar el tiempo que el analizador metabólico medirá el cerebro cambiando la basal medida tiempo de ciclo "3:00" el arriba y abajo flechas.</li>
		<li>Ajustar el tiempo que esperará el analizador metabólico entre las mediciones del cerebro cambiando la basal espera tiempo de ciclo a "0:00" el arriba y abajo flechas.</li>
		<li>Ajustar el tiempo que el analizador metabólico mezcla los medios de comunicación antes de la medición del cerebro cambiando la basal mezcla tiempo de ciclo a "1:00" el arriba y abajo flechas.</li>
		<li>Ajustar el número total de ciclos de básicos, que incluye la medida, espera y ciclos de mezcla, "7" el arriba y abajo flechas. Nota: Las mediciones de la tasa estable de consumo de oxígeno se obtienen después de ~ 25 min desde el inicio del ensayo.</li>
		<li>Haga clic en el botón "Añadir inyección", situado en la barra de herramientas izquierda superior.</li>
		<li>Haga clic en la etiqueta de"inyección" y cambiar a "Oligomycin".</li>
		<li>Ajustar la medida de la inyección, esperar y tiempos de mezclado para que coincida con los de la basal.</li>
		<li>Ajustar el número total de ciclos de inyección a "6" el arriba y abajo flechas.</li>
		<li>Repita los pasos 3.7.6 - 3.7.8 pero cambie la etiqueta a "Putrefacción/AA" y ajustar el número total de ciclos de inyección a 7 el arriba y abajo flechas.</li>
		<li>Haga clic en el botón "Ejecutar análisis" en la barra de herramientas superior.</li>
		<li>"Salvar" el ensayo y empezar a configurar el cartucho de análisis (Tabla de materiales).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. preparación del cartucho para la calibración (día 2)
<ol><li>
Extraiga el cartucho de la incubadora de 25 ° C y sacar la cubierta.
	<ol>
<li>20 μL de 100 μM oligomycin al puerto de inyección circular izquierda superior pequeña, A puerto, en el cartucho para pozos experimentales todos correspondientes en la placa celular y añadir 20 μL del medio de ensayo al puerto A en todos los otros pozos, incluyendo el control y fondo de los pozos. Nota: El cartucho contiene 4 puertos (A, D) para cada uno de los 96 pozos correspondientes a la placa de la célula que contiene las muestras. Este paso se realiza antes de las muestras. Agregar 20 μL de 100 resultados de oligomycin μM en una concentración final oligomycin de 10 μM en la placa del celular bien una vez que el fármaco se inyecta por el analizador metabólico. Oligomycin es un inhibidor de la sintasa de ATP. El valor de consumo de oxígeno resultante reflejará la cantidad de ATP-ligado la respiración en el cerebro. Para inyectarse adecuadamente en los pocillos especificados, todos los puertos de la misma carta deben llenarse con el mismo volumen de líquido, incluso si no en uso.</li>
		<li>22 μL de 50 μM rotenona/antimycin al pequeño puerto circular derecha superior, Puerto B, en el cartucho para pozos experimentales todos correspondientes en la placa de la célula y añadir 22 μL del medio de ensayo al puerto B de todos los otros pozos, incluyendo el control y fondo de los pozos. Nota: Esto resulta en un rotenona final: Antimycin una concentración de 5 μM en la placa del celular bien una vez que el fármaco se inyecta por el analizador metabólico. Rotenona y la antimicina A son inhibidores del transporte de electrones de la cadena de complejos I y III, respectivamente. El valor de consumo de oxígeno resultante reflejará la respiración no mitocondrial en el cerebro.</li>
		<li>Haga clic en "Inicio ejecutar" para colocar el cartucho cargado con la placa de utilidad en el analizador metabólico con A1 bien colocado en la esquina superior izquierda, al frente del instrumento, con el cargador de la placa que se extiende desde el lado derecho de la máquina.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Seleccione "Estoy listo" en el software para comenzar el equilibrado y la calibración del cartucho antes de iniciar el análisis metabólico con la placa de la célula que contiene las muestras. Nota: El programa le preguntará guardar el archivo y luego comenzar equilibrar y calibrar. Estos pasos pueden tomar hasta 1 h. pasos 5 – 8 se llevan a cabo durante el tiempo de equilibrado y calibración.</li>
</ol>5. preparación de las Micro-tejidos limitantes (día 2)
<ol><li>Seleccione 1 retención de micro-tejido por el cerebro que se está midiendo, además de al menos 3 para su uso como controles sólo moderación, desde el contenedor de almacenamiento de información (contiene etanol al 70%).</li>
	<li>Enjuague las restricciones con etanol al 70% fresco y lavado con agua desionizada 3 x por 2 min cada una, utilizando una cesta de malla y placa de 6 pozos (Tabla de materiales). Agregar agua adicional lava si las restricciones todavía despiden un olor de alcohol.</li>
	<li>Lavar las restricciones micro-tejido en medio de ensayo y les dejan en esta solución hasta que están listos para su uso.</li>
</ol>6. disección de la Drosophila melanogaster cerebros Larval (día 2)
<ol><li>Seleccione finales (errante) tercer instar las larvas de un frasco de cultivadas moscas de Oregon-R con alta precisión, estilo 5 pinzas (0,10 x 0,06 mm2).</li>
	<li>Coloque la larva en el pozo de una placa punto disección limpia (Tabla de materiales) conteniendo 500 μL de PBS 1 x. Nota: Una punto placa es una placa de vidrio con depresiones, utilizado para disecar organismos y tejidos pequeños.</li>
	<li>Lave la larva agitando suavemente en el pozo, con pinzas.</li>
	<li>Hacia el pozo limpio de una placa de punto conteniendo 500 μL de PBS 1 x a la larva.</li>
	<li>Coloque la placa punto bajo el microscopio de disección.</li>
	<li>Agarre la larva en su abdomen con un par de pinzas, mientras agarra los ganchos de ojo con un segundo par de pinzas.</li>
	<li>Con cuidado y suavemente tire la larva en direcciones opuestas usando los dos juegos de pinzas.</li>
	<li>Visualizar el cerebro, que normalmente permanece conectada a los ganchos de ojo y comúnmente habrá discos ojo antenal unido a él.</li>
	<li>Retire con cuidado los tejidos adicionales del cerebro, utilizando los ganchos de ojo para mantener el cerebro en su lugar. Por último, separar los ganchos de ojo en el cerebro.</li>
	<li>Utilice pinzas para mover el cerebro disecado a un nuevo pozo en una placa lugar que contiene 1 x PBS.</li>
	<li>Repita los pasos 6.1 – 6.10 hasta 14 cerebros se disecan. Nota: El tiempo total desde el inicio de la disección a la ejecución del ensayo no debe exceder los 30 minutos.</li>
</ol>7. Además de los cerebros disecados a la placa de la célula de análisis metabólico de 96 pocillos (día 2)
<ol><li>Añada 50 μL del medio de ensayo a los pocillos de la placa de ensayo metabólico de 96 pozos (Tabla de materiales) se utiliza en el experimento, incluyendo los experimentales, control, sólo alojamiento y pozos de fondo.</li>
	<li>Coloque cuidadosamente un cerebro en cada pozo de A2-A8 y B8 de B2 de la placa de la célula, utilizando unas pinzas, una espátula o una pipeta. Nota: Esto se puede hacer del microscopio de disección.</li>
	<li>Bajo el microscopio de disección, utilizar una sonda de micro agujas despuntadas para el cerebro en la parte inferior del pozo.</li>
	<li>Suavemente Coloque el cerebro en el medio de las tres esferas elevados uso de la sonda.</li>
</ol>8. Además de las limitantes de Micro-tejido a la placa de la célula de análisis metabólico de 96 pocillos (día 2)
<ol><li>Utilizando pinzas, coloque bien la retención de micro-tejido en el borde de la placa de ensayo y utilizar el microscopio para la inspección que se orienta con el anillo de plástico hacia abajo y la malla en la parte superior.</li>
	<li>Retire la placa debajo del microscopio y utilice unas pinzas para sujetar el asiento de seguridad en ambos lados y caer suavemente en el pozo.</li>
	<li>Utilice una aguja doblada micro-sonda para empujar la restricción en el pozo.</li>
	<li>Bajo el microscopio, verificar que el cerebro puede verse a través de la retención de tejido y que se centra en el pozo.</li>
	<li>Repita los pasos 8.1-8.4 para todos los pozos que en el ensayo: A2-A8, B8 B2 y C2-C8.</li>
	<li>Cuidadosamente añadir 130 μL de medios de ensayo para cada uno de lo experimental, control y pozos de retención.</li>
	<li>Verificar que los cerebros y las restricciones del tejido micro no han movido mientras que la adición de los medios de comunicación por visualización al microscopio.</li>
	<li>Añadir 180 μL del medio de ensayo a los pozos de cuatro esquinas para uso como control de fondo.</li>
</ol>9. Además de la placa de la célula para el analizador metabólico y el inicio del ensayo (día 2)
<ol><li>Para comprobar que el equilibrado y la calibración completadas esperando el software solicitar la placa de la célula que contiene la muestra.</li>
	<li>Seleccione "Abrir bandeja" y esperar a que el instrumento extraer la placa de utilidad.</li>
	<li>Retire la placa de utilidad y agregan la placa de la célula, sin la tapa, en la misma orientación.</li>
	<li>Seleccione "célula plato de carga" para el instrumento en la placa celular y cerrar la bandeja y luego comenzar el ensayo.</li>
	<li>Ver las mediciones en tiempo real con barras de error en la pantalla del ordenador que ejecuta el software.</li>
	<li>Retire el cartucho y expulsado de la célula la placa cuando el ensayo se completa. Nota: Emparejados cartuchos y placas de células puede ser usado de nuevo 5 x.</li>
</ol>10. medición posterior análisis (día 2)
<ol><li>Utilice un microscopio de disección para verificar los cerebros y las restricciones del tejido micro son todavía en la posición correcta en el pozo después de que el ensayo ha terminado. Excluir cualquier pozos con anormalidades de los análisis.</li>
	<li>Exportación de la tasa de consumo de oxígeno (OCR) y los datos de la tasa de acidificación extracelular (ECAR) para su posterior análisis.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Cai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+dysfunction+in+Alzheimer's+disease+and+related+neurodegenerative+disorders.">Metabolic dysfunction in Alzheimer's disease and related neurodegenerative disorders.</a> Current Alzheimer Research. 9 (1), 5-17 (2012).</li><li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma-derived+mutations+in+IDH1+dominantly+inhibit+IDH1+catalytic+activity+and+induce+HIF-1alpha.">Glioma-derived mutations in IDH1 dominantly inhibit IDH1 catalytic activity and induce HIF-1alpha.</a> Science. 324 (5924), 261-265 (2009).</li><li>Brody, A. 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Vuelco de M. tiene una patente provisional para las restricciones del tejido micro que se describe en este protocolo17.

Aquí, se describe un método novedoso para el análisis metabólico de cerebros de larvas y adultos de D. melanogaster ex vivo . Bajo condiciones basales, el consumo de oxígeno y las tasas de acidificación extracelular indican cómo metabólicamente activo el cerebro es y puede determinar si un tejido se ha vuelto más dependiente mitocondrial frente a glucolisis respiración, respectivamente11.
Tratamiento de los cerebros con inhibidores o medicamentos puede proporcionar más información sobre el estado metabólico del tejido. También se pueden añadir sustratos metabólicos para determinar las dependencias de metabolitos específicos, como la glucosa para comprobar el efecto de Warburg22 o glutamina para investigar glutaminolysis23, ambos comunes en reprogramación metabólica. Estudios a largo plazo, larvas o moscas podrían también ser alimentadas con drogas en vez de usar puertos de inyección y cerebros podrían ensayarse en intervalos o en el punto final, dependiendo del diseño experimental. Este método se puede optimizar para numerosas aplicaciones.
Este método ha sido optimizado para cerebros pero puede ser utilizado para analizar otras larvas18 y tejidos adultos. Además, otros sistemas modelo pequeño pueden utilizar este método para medir todo organismos18 o los tejidos. La única limitación para la optimización de este método para otros sistemas es el tamaño del órgano, tejido u organismo. La cámara creada por la retención de micro-tejido es la barrera de tamaño para ejecutar el ensayo. Si la salida metabólica es demasiado baja para el cerebro o el tejido sometido a prueba, y el tamaño de muestra no es una restricción, agrupación de muestras puede utilizarse para aumentar las medidas de análisis y sensibilidad. Modificar este protocolo para otras aplicaciones sólo necesitan optimizaciones menores, incluyendo: 1) elección de la medida adecuada y mezclar números de ciclo y tiempo y 2) determinación de las concentraciones de tratamiento eficaz para el tejido. La medida y tiempos de mezcla se determinaron mediante el control concentración de oxígeno medida por el analizador metabólico durante cada ciclo. Esto puede verse seleccionando O2 en el botón de eje Y2 en la ventana de resumen después de terminar la carrera. Durante cada ciclo, debe haber una concentración de oxígeno de sobreponer lo que refleja el consumo de oxígeno del tejido durante el tiempo medido, seguido por un retorno a la concentración de oxígeno inicial durante el ciclo de mezcla. Deben analizarse los tiempos de medida y mezcla hasta que este patrón se observa. Usando este método, se han estudiado otros cerebros insectos. Estos cerebros eran más grandes que los cerebros de moscas utilizado aquí, pero aún encaja dentro de la cámara generada por la retención de tejido. La lectura OCR de estos cerebros era tan alta como 400 pmol/min (datos no mostrados). Los resultados de estos estudios, así como las tasas de la OCR que se alinean con otros estudios de medición de oxígeno toda marcha consumo18,24, sugieren que los cerebros de D. melanogaster no eran oxígeno limitado. Para D. melanogaster cerebros y tejidos de otros organismos, aplicando este método exige una atención especial a cuatro pasos críticos.
Para alcanzar con éxito mediciones reproducibles y biológicamente relevantes, hay pasos críticos del protocolo que debe seguirse. En primer lugar, el uso de un micro-tejido de sujeción se requiere para este método. Estas restricciones utilizando las especificaciones y materiales listados de fabricación es esencial. Los materiales fueron seleccionados debido a su composición química inerte y su capacidad para permitir el intercambio adecuado de los medios de comunicación durante las etapas de mezcla sin la creación de burbujas de aire. En segundo lugar, una preparación oportuna de la disección y la placa es necesaria para maximizar la producción metabólica del tejido. Tiempos cortos disección no deben deterioran significativamente el cerebro. Otros estudios han demostrado que cerebros de mosca pueden mantener vivos a horas o días después de disección si se almacena correctamente en una perfusión cámara25. Sin embargo, como se ve en la figura 3B y 3D, si los cerebros se quedan sentado en medio de ensayo durante largos períodos de tiempo antes de la prueba, se disminuyen las tasas de consumo de oxígeno. Durante el ensayo, las muestras se someten a un paso de la mezcla durante cada ciclo. Esta mezcla no sólo ayuda con las inyecciones de compuestos químicos sino también actúa para recircular los medios de comunicación y proporcionar oxígeno. Los cerebros son capaces de permanecer metabólicamente activos durante períodos más largos durante estos ciclos de medida-mix que incubando en los medios de comunicación en la mesa. Por lo tanto, la disección del cerebro larval debe ser dominada antes de comenzar a configurar este ensayo. Cuando la configuración de este ensayo, analizar un pequeño número de genotipos a la vez, minimizar el número de cerebros necesarios y pozos utilizaron. Esto evitará retrasos entre la disección y las mediciones de ensayo. En tercer lugar, mantener una temperatura estable es necesaria para analizar las tasas metabólicas en condiciones fisiológicamente relevantes. Temperaturas de ensayo mayor pueden causar muerte del tejido, observada por menores tasas de consumo de oxígeno (figura 3). Si de moscas se crían a temperaturas diferentes para fines experimentales, las mediciones deben realizarse en esta temperatura. Mientras que las disecciones más probable es que se realizará a temperatura ambiente, si el ensayo se llevará a cabo a una temperatura diferente, los cerebros plateados y restringidos deben incubarse a la temperatura requerida durante 15 min antes de ejecutar el ensayo. Por último, observar el análisis posterior de pozos es fundamental para determinar si la colocación de tejido afectados las mediciones. En ocasiones, habrá un outlier bien que, después de observar la placa con el microscopio de disección, se puede eliminar desde el análisis de los datos debido a cualquier pérdida de tejido o deformación, donde el cerebro se ha deslizado fuera del centro del pozo y se pega debajo del anillo de polímero de la moderación. Tejido puede perder si la restricción no fue asegurada correctamente al pozo y fue perturbada durante los ciclos de mezcla. Mientras que ninguno de estos eventos sucede a menudo, si no son excluidos del análisis, se bajan los valores de tasa sustancialmente.
La medición de flujo metabólico tejido conjunto de monitoreo de consumo de oxígeno y la acidificación extracelular proporciona un método biológico relevante para la comprensión de cómo metabolismo está alterado por el paisaje genético u otras condiciones experimentales. Este método es lo suficientemente sensible para detectar cambios metabólicos en un solo cerebro de D. melanogaster , que no es posible mediante respirometría de flujo de parada o calorimetría indirecta. También es menos técnicamente difícil que utilizando un electrodo de Clark para medir consumo de oxígeno. Una ventaja adicional de este protocolo es la capacidad de analizar un cerebro entero por pozo. El formato de 96 pocillos permite lecturas más sensibles, y por lo tanto, más de un genotipo puede ensayarse en un momento por el menor número de muestras necesarias por ensayo. Medición de metabolismo en el tejido es todavía un reto y requiere cuidadosamente criados y animales sincronizados, este protocolo describe un método rápido y relativamente simple y tiene el potencial para analizar numerosos sensibilidad metabólica en D. melanogaster cerebros de larvarios y adultos.

La reprogramación metabólica ha sido identificado en muchas enfermedades neurológicas, incluyendo Glioblastoma Multiforme (GBM), enfermedad de Huntington y desorden depresivo importante (MDD)1,2,3. Como metabolismo se convierte en el foco de las estrategias terapéuticas, herramientas para la investigación metabólica básica han avanzado. Sin embargo, la mayoría de estos métodos fueron diseñada para el estudio de líneas celulares y células primarias o analizar grandes tejidos posteriores a la fijación o - congelación. Algunos enfoques han dependido de los kits a medida simplista metabolitos específicos, mientras que otros han utilizado más costosos y complejos análisis utilizando cromatografía en combinación con la espectrometría de masas4 para el mismo objetivo. Para entender el paisaje metabólico mayor,5,6 y el análisis de flujo metabólico de perfiles metabólicos (MFA)7 surgió para complementar los estudios de Genómica proteómica a gran escala. Perfiles proporciona una representación cuantitativa de los metabolitos de una célula o tejido en un punto en el tiempo, mientras que la AMF se amplía sobre esto por que permite el seguimiento de los metabolitos marcados en el tiempo. Esta última ha sido útil en revelar cómo las fuentes de energía se utilizan diferentemente en una célula o tejido en un estado de enfermedad8. Sin embargo, estos métodos incluyen la medición de la tasa metabólica en general.
Para interrogar el estado metabólico general de los sistemas de modelo pequeño, métodos tradicionales, como el electrodo de Clark9 y10de la calorimetría indirecta, pueden ser utilizados para medir el consumo de oxígeno o configurados para parada de respirometría de flujo, a medir la concentración de dióxido de carbono y oxígeno respectivamente. Estas técnicas, ofreciendo con precisión conocer la lectura de reprogramación metabólica a nivel de organismo, tienen limitaciones. El uso del electrodo de Clark puede ser técnicamente difícil y no está diseñado para estudios de alto rendimiento. El respirómetro de flujo de parada no puede funcionar con la sensibilidad necesaria para análisis de células o tejidos. Hace varios años, la nueva tecnología fue desarrollada específicamente para estas pequeñas aplicaciones11. Estos instrumentos fueron diseñados inicialmente para medir el consumo de oxígeno y la acidificación extracelular de líneas celulares y células primarias en un formato de 24 o 96 pocillos. La simplicidad de la configuración y datos de salida había establecido este método como alternativa a los enfoques tradicionales. Esta metodología es una herramienta poderosa para las células, y los avances recientes han permitido la medición de tejido golpes12,13,14. Sin embargo, los métodos utilizados en estos ensayos no permiten la medición de órganos completos de sistemas modelo pequeño.
El análisis metabólico de modelos de la enfermedad a menudo implica la interacción entre las células de función especializada que se encuentra en el mismo tejido. Por ejemplo, las células gliales producen metabolitos utilizados por las neuronas. Estas interacciones metabólicas son necesarias para la supervivencia neuronal15. Sistemas modelo pequeño son ventajosos para investigar preguntas como éstas. Estudios para medir el metabolismo de un órgano entero, que contiene una variedad de tipos celulares, se sumará a la comprensión de la utilización de energía en vivo. Becker et al informó recientemente, un método para medir el consumo de oxígeno en toda mosca cabezas16. Poniendo un número de cabezas juntos en un pocillo de una placa de 24 pocillos celular, las lecturas de consumo de oxígeno fueron obtenidas usando un analizador metabólico. Aunque esto funciona bien para las cabezas, que se separan fácilmente del cuerpo, es mucho más difícil para órganos como el cerebro de larvas, ya que una gran cantidad necesita ser disecado para este método. Por lo tanto, se desarrolló un método utilizando una placa de 96 pocillos de la célula, que aumenta la sensibilidad de las lecturas de acidificación extracelular y consumo de oxígeno, para ensayo un solo cerebro entero larval.
El analizador metabólico utilizado en este estudio requiere que la muestra se mide para permanecer en el fondo del pozo de una placa celular de 96 pozos. Para las células y tejidos relativamente planos, esto no es un reto; sin embargo, para D. melanogaster cerebros de larvas y adultos, no es posible usando protocolos de capa de placa tradicional. La forma tridimensional esférica de los cerebros no fiable se adhiere a la superficie de la placa, y los que lo hacen a menudo están dañados al intentar colocarlos correctamente en el pozo. Una parte crítica de este nuevo protocolo es el diseño y desarrollo de micro-tejido restricciones17 que proporcionar un compartimiento pequeño para el cerebro a residir en sin interferir con las mediciones metabólicas. La cámara generada es de aproximadamente 0,016 en altura y ofrece suficiente espacio para contener fácilmente muchos cerebros de D. melanogaster . Las restricciones consisten en malla de nylon unido a un anillo de polímero inerte y se discutirá más en los Resultados de representante. Usando estas restricciones minimiza el tiempo necesario para preparar la medición metabólica cerebros disecados. Optimizar el proceso de medición genera acidificación extracelular tarifas y consumo de oxígeno constante, reproducible después de seis ciclos de medición (de 25 min). Los cerebros siguen siendo metabólicamente activos bajo estas condiciones durante un mínimo de 2 h, que permite inyecciones de terapéutica, los inhibidores u otros tratamientos a través de los puertos de la entrega de la droga de analizador metabólico cartucho. Este protocolo también puede ser fácilmente adaptado para otros tejidos y sistemas de modelo pequeño18.
El protocolo que se detalla a continuación describe cómo analizar el consumo de oxígeno en un todo cerebro larvas de Drosophila cuando con estrés mitocondrial. Al estrés del cerebro, oligomycin se agrega al inhibir la sintasa de ATP19. La disminución en el consumo de oxígeno basal lecturas muestra una medida de la cantidad de ATP dependiendo de la respiración en el cerebro. Otras disminuciones en el consumo de oxígeno después de tratamientos con rotenona20 y antimycin A21, inhibidores de los complejos de la cadena de transporte de electrones I y III, respectivamente, indican la cantidad de consumo de oxígeno no mitocondrial en el cerebro. Este ensayo es un ejemplo de respiración mitocondrial como en un cerebro de mosca puede compararse y cómo este protocolo se puede utilizar para comparar el metabolismo en diferentes genotipos. Sin embargo, este protocolo puede ser adaptado para medir consumo de oxígeno basal simplemente y tipos de acidificación extracelular, así como en cuanto a diseño más elaborados estudios investigando la utilización de la energía específica o hipótesis de utilización de sustrato.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Assay medium</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102365-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calibrant solution</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>100840-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Cell-Tak Cell Tissue Adhesive</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>DLW354240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>delrin</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>2XMK6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Schneider Media</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>21720-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont High Precision Tweezers (style 5)</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>5622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loctite 409</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitostress kit&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103015-100</td>
			<td>oligomycin, rotenone, and antimycin A included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Netwell inserts (6-well)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>29442-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nylon mesh</td>
			<td>Component Supply</td>
			<td>U-CMN-64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M wrapping film</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S37440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX spot plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-748B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wave v2.4 XFe96 analyzer software</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/software-download-for-wave-desktop</td>
			<td>free download to mac or windows</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFe96 catridge and cell plates</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102416-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

metabolic analysis of drosophila melanogaster larval and adult brains

Este protocolo describe un método para medir el metabolismo en el cerebro de larvas y adultos de Drosophila melanogaster . Cuantificación de metabolismo en órganos enteros proporciona un conocimiento de tejido nivel de utilización de la energía que no puede ser captada cuando se analizan líneas celulares y células primarias. Si bien este análisis es ex vivo, permite la medición de una serie de células especializadas que trabajan juntos para realizar una función en un tejido y modelos más de cerca el órgano en vivo . La reprogramación metabólica se ha observado en muchas enfermedades neurológicas, incluyendo neoplasias y enfermedades neurodegenerativas. Este protocolo fue desarrollado para ayudar a la investigación de la comunidad de D. melanogaster de metabolismo en modelos de enfermedad neurológica utilizando un analizador metabólico comercialmente disponible. Medición de metabolismo del cerebro entero en el analizador metabólico es difícil debido a la geometría del cerebro. Este analizador requiere muestras para permanecer en la parte inferior de una placa de 96 pocillos. Muestras de células y tejidos punzonados pueden adherirse a la superficie de la placa celular o utilizar placas de esferoide, respectivamente. Sin embargo, la forma esférica, tridimensional del cerebro de D. melanogaster impide que el tejido adherido a la placa. Este protocolo requiere una restricción de micro-tejido especialmente diseñada y fabricada que evita este problema evitando cualquier movimiento del cerebro mientras sigue permitiendo las mediciones metabólicas de dos sondas de sensor de estado sólido del analizador. Consumo de oxígeno y las tasas de acidificación extracelular son reproducibles y sensibles al tratamiento con inhibidores metabólicos. Con una optimización menor, este protocolo puede ser adaptado para su uso con cualquier tejido entero o modelo de sistema, siempre que el tamaño de la muestra no excede la cámara generada por el sistema de seguridad. Mientras que dentro de este protocolo se describen las mediciones metabólicas basales y un análisis después de un tratamiento con los inhibidores mitocondriales, innumerables condiciones experimentales, tales como preferencia de fuente de energía y medio ambiente de crianza, podrían ser interrogadas.

El protocolo presentado aquí requiere el uso de restricciones de micro tejidos que cumplen con las especificaciones que se describen a continuación. Otros métodos para mantener el cerebro en su lugar en la parte inferior de la placa de 96 pocillos celular era fracasado (figura 2A y 2B). En primer lugar, probaron a varios agentes para aumentar la adherencia del tejido a la placa. Un adhesivo de tejido disponible en el mercado (Tabla de materiales) se recomienda para el uso de las células y organoides con placas celulares y placas de esferoide, respectivamente. Inicialmente, cerebros parecen adherirse a la superficie bien; sin embargo, las lecturas de consumo (OCR) de oxígeno son bajas, y observando los pozos después del ensayo reveló que los cerebros no fueron Unidos a la superficie bien (figura 2A). Los mismos resultados se produjeron con pegamento (figura 2A). A continuación, fabricación de pantallas pequeñas para mantener el cerebro dentro de una pequeña cámara en la parte inferior del pozo se ha intentado (figura 2B).
Pantallas metálicas producen lecturas altas de OCR solas, como pantallas de metal con un anillo de polímero que mantiene la pantalla en su lugar (figura 2B). Red de malla de plástico fue utilizado con el mismo anillo de polímero. Este dispositivo causa una lectura negativa de OCR obtener. Finalmente, las restricciones del tejido micro fueron diseñadas utilizando un polímero inerte para el anillo de un diámetro exterior de 0,146 en un diámetro interno de 0.1335 en un grueso de 0.0125 en y una altura de 0,016 en (deTabla de materiales). Pegamento (Tabla de materiales) fue utilizado para colocar el anillo a una malla de nylon con un tamaño de poro específico de 0.0039 en diámetro (Tabla de materiales). El tamaño del poro es crítico, ya que permite el intercambio de los medios de comunicación y metabolito sin la formación de burbujas de aire, sin embargo, todavía actúa como una barrera para el cerebro. Estas restricciones sólo resultan en poco o ningún OCR lectura y cuando se utiliza con cerebros, permiten lecturas reproducibles (figura 2A y 2B). La verificación después de que el análisis demostró que los cerebros estaban todavía en la posición correcta en los pozos. Estas restricciones de tejido no están comercialmente disponibles pero pueden fabricarse siguiendo la especificación antedicha. Mientras que esto requiere fabricación precisa, la mayoría tiendas de máquina será capaces de reproducir este asiento de seguridad utilizando los materiales anteriormente.
El protocolo se ha optimizado aún más para tener en cuenta los medios de prueba, el tiempo permitido antes de ejecutar el ensayo y la temperatura (figura 3). Inicialmente, los ensayos se establecieron en el medio de Schneider para modelar el ambiente larval en vivo . Sin embargo, los medios utilizados no contienen agentes tampón ya que el pH se utiliza para medir la ECAR. Este medios, por lo tanto, tienen que ser personalizado hecho, que es costoso. Para optimizar esto, se utilizan un medios de análisis disponibles en el mercado diseñado para el análisis metabólico (Tabla de materiales) en lugar de los medios de comunicación de Schneider. Los niveles de OCR eran sin cambios, incluso cuando el aumento de los niveles de glucosa un poco a las condiciones modelo ensayo medios de comunicación (Figura 3A). Desde este punto en todos los ensayos se llevaron a cabo en el medio de ensayo. Los suplementos a los medios de comunicación fueron optimizados mediante la observación de si el consumo de oxígeno y las tarifas de acidificación extracelular demostraron una respuesta al tratamiento con los inhibidores mitocondriales conocidos. A continuación, se analizó el tiempo de espera entre las disecciones y los funcionamientos de ensayo. Una incubación de 3 h disminuyó significativamente los niveles de OCR (figura 3B). Figura 3D muestra la diferencia en el sexto punto de tiempo, que es cuando los niveles de OCR y ECAR estabilizan para cerebros adultos y larvas. Así, el protocolo indica que para empezar el ensayo inmediatamente después de las disecciones, a menos que el experimento requiere un equilibrio de temperatura, en que caso una incubación de menos de 30 minutos se sugiere. El analizador metabólico se almacena en una incubadora que se establece en 11 ° C para permitir una temperatura de 25 ° C durante todo el ensayo. Si las temperaturas son elevadas debido a la temperatura ambiente y a la operación del equipo, los niveles reducidos de OCR se observan (figura 3). Esto se presume para ser debido a la muerte del tejido.
Cuando se siguen las condiciones optimizadas, los ensayos con larvas y adultos cerebros resultado lecturas de OCR ligeramente superior a 150 pmol/min en la estabilizado tiempo sexto punto, ~ 25 min en el ensayo (Figura 4B). Esta tasa se mantiene por al menos 30 min (Figura 4A) y hasta 2 h (datos no mostrados). La ECAR es ligeramente inferior en el cerebro adulto que en el cerebro de larvas en el punto sexto del tiempo (figura 4) y se mantiene durante al menos 30 minutos (figura 4). Este hallazgo corresponde a un aumento de la glicolisis durante las etapas larvales para apoyar el crecimiento. Una inyección con un inhibidor mitocondrial, como oligomycin, reduce las lecturas de OCR para revelar la respiración dependiente de ATP y más tratamiento con rotenona y antimycin A baja el OCR para revelar el consumo de oxígeno no mitocondrial (figura 5A ). Este dato demuestra que estos inhibidores son capaces de penetrar en el tejido cerebral y pueden ser usados para comparar la respiración mitocondrial en los cerebros de diferentes genotipos. Para este ensayo, la mezcla, esperar, y momentos de medida fueron optimizados por observación de los niveles de oxígeno, no la tasa de consumo y que después de la mezcla, el nivel de oxígeno volvió al nivel de antes de la medición.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58007/58007fig1.jpg"> Figura 1: esquema de las mediciones de OCR y ECAR de cerebro larvas en el analizador metabólico. El cartucho se prepara un día antes de ejecutar el ensayo. Al día siguiente, las drogas se agregan a los puertos de inyección del cartucho. Cerebros de larvas de D. melanogaster se disecan, y se micro-tejido restricciones para garantizar el cerebro a la parte inferior del pozo. La placa de la célula con los cerebros se ensayaron en el analizador metabólico y los datos son analizados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58007/58007fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58007/58007fig2.jpg"> Figura 2: Micro-tejido restricciones no son metabólicamente activas y mantienen el cerebro en una cámara en la parte inferior de una placa bien. (A) el OCR de cerebros larvas melanogaster Oregon-R D. se mide en pocillos recubiertos con adhesivo tisular (Tabla de materiales) o cuando los cerebros son super pegados en el fondo del pozo. Los resultados se comparan con los de cerebro colocado en la parte inferior del pozo utilizando micro-tejido restricciones. (B) el OCR se mide en pocillos que contengan medios de ensayo y metal, metal con un anillo de polímero, red de malla de plástico y un anillo de polímero o micro-tejido restricciones. p-valor < 0.05, ** p-valor < 0,01, *** p-valor < 0.001, *** p-valor < 0.0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58007/58007fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58007/58007fig3.jpg"> Figura 3: optimización de los medios de comunicación, tiempo de incubación y temperatura. (A) el OCR es medido en Oregon-R D. melanogaster larvas cerebros medios Schneider (S2) con piruvato de sodio añadido, S2 con glucosa y piruvato de sodio añadido, ensayo medios con glucosa y sodio piruvato añadido. (B) el OCR se mide en el cerebro de larvas después de 3 h de incubación antes de la prueba, o después de 30 min de incubación antes de la prueba. (C) el OCR se mide en el cerebro de larvas en serie temperaturas de 33 ° C y 25 ° C. El sexto punto del tiempo se graficaron. (D) el OCR se mide en el cerebro de larvas después de 3 h de incubación antes de la prueba, o después de 30 min de incubación antes de la prueba. Los datos se divulga para el sexto punto del tiempo. p-valor < 0.05, ** p-valor < 0,01, *** p-valor < 0.001, *** p-valor < 0.0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58007/58007fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58007/58007fig4.jpg"> Figura 4: El OCR y ECAR reproducible se miden en adulto y larval de D. melanogaster cerebros. (A) el OCR se mide en cerebros de adultos y larvas de Oregon-R D. melanogaster por 30 min (B) datos de la OCR del sexto punto de tiempo del panel A se graficaron. Este es el momento en que se estabilice la lectura OCR. ECAR el (C) se mide en cerebros de adultos y larvas de D. melanogaster por 30 min (D) datos de la ECAR del sexto punto de tiempo del panel A se graficaron. Este es el momento en que las lecturas de ECAR estabilizan. p-valor < 0.05, ** p-valor < 0,01, *** p-valor < 0.001, *** p-valor < 0.0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58007/58007fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58007/58007fig5.jpg"> Figura 5: Oligomycin disminuye los niveles de cerebro larvas OCR de D. melanogaster a revelar respiración dependiente de ATP, y rotenona/antimycin A otros baja el OCR para revelar el consumo de oxígeno mitocondrial-no. (A) el OCR se mide en cerebros larvas melanogaster Oregon Rd después de un tratamiento con un 20 oligomycin μm y 5 μm rotenona/antimycin A mezcla. El control y la moderación sólo pozos fueron inyectados con los medios de ensayo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58007/58007fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

Presentamos un protocolo para la medición de consumo de oxígeno y la acidificación extracelular en el cerebro de larvas y adultos de Drosophila melanogaster . Se utiliza un analizador metabólico con un protocolo adaptado y optimizado. Micro-tejido restricciones son un componente fundamental de este protocolo y fueron diseñadas y creadas específicamente para su uso en este análisis.

Análisis metabólico del cerebro adulto y Larval de Drosophila melanogaster

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

9.2K vistas.  Providence College. Presentamos un protocolo para la medición de consumo de oxígeno y la acidificación extracelular en el cerebro de larvas y adultos de Drosophila melanogaster . Se utiliza un analizador metabólico con un protocolo adaptado y optimizado. Micro-tejido restricciones son un componente fundamental de este protocolo y fueron diseñadas y creadas específicamente para su uso en este análisis.

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Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of its convenient genetics and fully sequenced genome. Additionally, the larval nervous system is an ideal model system to study mechanisms of axonal transport as the larval segmental nerves contain bundles of axons with their cell bodies located within the brain and their nerve terminals ending along the length of the body. Here we describe the procedure for visualization of synaptic vesicle proteins within larval segmental nerves. If done correctly, all components of the nervous system, along with associated tissues such as muscles and NMJs, remain intact, undamaged, and ready to be visualized. 3rd instar larvae carrying various mutations are dissected, fixed, incubated with synaptic vesicle antibodies, visualized and compared to wild type larvae. This procedure can be adapted for several different synaptic or neuronal antibodies and changes in the distribution of a variety of proteins can be easily observed within larval segmental nerves.

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster larvae provide an ideal model system to investigate the mechanisms of axonal transport within larval segmental nerves. Using this procedure, 3rd instar larvae carrying various mutations can be compared to wild type larvae.

La visualización de larvas Nervios segmentarios en 3 Rd Instar Drosophila Preparación de larvas

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of ...

Investigación

Neurociencias

Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

The Gal4/ UAS binary method is powerful for gene and neural circuitry manipulation in Drosophila. For most neurobiological studies, however, Gal4 expression is rarely tissue-specific enough to allow for precise correlation of the circuit with behavioral readouts. To overcome this major hurdle, we recently developed the FINGR method to achieve a more restrictive Gal4 expression in the tissue of interest. The FINGR method has three components: 1) the traditional Gal4/UAS system; 2) a set of FLP/FRT-mediated Gal80 converting tools; and 3) enhancer-trap FLP (ET-FLP). Gal4 is used to define the primary neural circuitry of interest. Paring the Gal4 with a UAS-effector, such as UAS-MJD78Q or UAS-Shits, regulates the neuronal activity, which is in turn manifested by alterations in the fly behavior. With an additional UAS-reporter such as UAS-GFP, the neural circuit involved in the specific behavior can be simultaneously mapped for morphological analysis. For Gal4 lines with broad expression, Gal4 expression can be restricted by using two complementary Gal80-converting tools: tubP&gt;Gal80&gt; ('flip out') and tubP&gt;stop&gt;Gal80 ('flip in'). Finally, investigators can turn Gal80 on or off, respectively, with the help of tissue-specific ET-FLP. In the flip-in mode, Gal80 will repress Gal4 expression wherever Gal4 and ET-FLP intersect. In the flip-out mode, Gal80 will relieve Gal4 repression in cells in which Gal4 and FLP overlap. Both approaches enable the restriction of the number of cells in the Gal4-defined circuitry, but in an inverse pattern. The FINGR method is compatible with the vast collection of Gal4 lines in the fly community and highly versatile for traditional clonal analysis and for neural circuit mapping. In this protocol, we demonstrate the mapping of FLP expression patterns in select ET-FLPx2 lines and the effectiveness of the FINGR method in photoreceptor cells. The principle of the FINGR method should also be applicable to other genetic model organisms in which Gal4/UAS, Gal80, and FLP/FRT are used.

Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

We describe a Flippase-induced intersectional Gal80/Gal4 repression (FINGR) method, allowing tissue-specific FLP to determine Gal80 expression patterns. Wherever Gal4 and FLP overlap, Gal4 expression is turned on (Gal80 flipped out) or off (Gal80 flipped in). The FINGR method is versatile for clonal analysis and neural circuit mapping.

La cartografía y la aplicación de potenciador de la trampa de expresión Flippase en larvas y adultos Drosophila SNC

The Gal4/ UAS binary method is powerful for gene and neural circuitry manipulation in Drosophila. For most neurobiological studies, however, Gal4 ...

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic development and axonal wiring. Recently the dendritic arborization (DA) sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system (PNS) have become powerful genetic models in which to elucidate both general and class-specific mechanisms of neuron differentiation.
There are four main DA neuron classes (I-IV)1. They are named in order of increasing dendrite arbor complexity, and have class-specific differences in the genetic control of their differentiation2-10. The DA sensory system is a practical model to investigate the molecular mechanisms behind the control of dendritic morphology11-13 because: 1) it can take advantage of the powerful genetic tools available in the fruit fly, 2) the DA neuron dendrite arbor spreads out in only 2 dimensions beneath an optically clear larval cuticle making it easy to visualize with high resolution in vivo, 3) the class-specific diversity in dendritic morphology facilitates a comparative analysis to find key elements controlling the formation of simple vs. highly branched dendritic trees, and 4) dendritic arbor stereotypical shapes of different DA neurons facilitate morphometric statistical analyses.
DA neuron activity modifies the output of a larval locomotion central pattern generator14-16. The different DA neuron classes have distinct sensory modalities, and their activation elicits different behavioral responses14,16-20. Furthermore different classes send axonal projections stereotypically into the Drosophila larval central nervous system in the ventral nerve cord (VNC)21. These projections terminate with topographic representations of both DA neuron sensory modality and the position in the body wall of the dendritic field7,22,23. Hence examination of DA axonal projections can be used to elucidate mechanisms underlying topographic mapping7,22,23, as well as the wiring of a simple circuit modulating larval locomotion14-17.
We present here a practical guide to generate and analyze genetic mosaics24 marking DA neurons via MARCM (Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker)1,10,25 and Flp-out22,26,27 techniques (summarized in Fig. 1).

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

The dendritic arborization sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system are useful models to elucidate both general and neuron class-specific mechanisms of neuron differentiation. We present a practical guide to generate and analyze dendritic arborization neuron genetic mosaics.

Análisis morfológico de Drosophila Larvas dendritas neurona sensorial periférica y axones Con mosaicos genéticos

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic ...

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for investigating the cell biology and development of central brain structures by allowing acute pharmacological interventions and live imaging of cellular processes. As an example of the technique, prior work from our lab1 has shown that a previously unrecognized subcellular compartment lies between the axonal and somatodendritic compartments of axons of the Drosophila central brain. The development of this compartment, referred to as the axon initial segment (AIS)2, was shown genetically to depend on the neuron-specific cyclin-dependent kinase, Cdk5. We show here that ex vivo treatment of wild-type Drosophila larval brains with the Cdk5-specific pharmacological inhibitors roscovitine and olomoucine3 causes acute changes in actin organization, and in localization of the cell-surface protein Fasciclin 2, that mimic the changes seen in mutants that lack Cdk5 activity genetically.
A second example of the ex vivo culture technique is provided for remodeling of the connections of embryonic mushroom body (MB) gamma neurons during metamorphosis from larva to adult. The mushroom body is the center of olfactory learning and memory in the fly4, and these gamma neurons prune their axonal and dendritic branches during pupal development and then re-extend branches at a later timepoint to establish the adult innervation pattern5. Pruning of these neurons of the MB has been shown to occur via local degeneration of neurite branches6, by a mechanism that is triggered by ecdysone, a steroid hormone, acting at the ecdysone receptor B17, and that is dependent on the activity of the ubiquitin-proteasome system6. Our method of ex vivo culturing can be used to interrogate further the mechanism of developmental remodeling. We found that in the ex vivo culture setting, gamma neurons of the MB recapitulated the process of developmental pruning with a time course similar to that in vivo. It was essential, however, to wait until 1.5 hours after puparium formation before explanting the tissue in order for the cells to commit irreversibly to metamorphosis; dissection of animals at the onset of pupariation led to little or no metamorphosis in culture. Thus, with appropriate modification, the ex vivo culture approach can be applied to study dynamic as well as steady state aspects of central brain biology.

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

This article describes a method by which one can mimic in vivo development of the Drosophila mushroom body in an ex vivo culture system.

Ex cultivo in vivo de la Plenaria, los cerebros en desarrollo de Drosophila

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for ...

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including lens-secreting cone cells, pigment cells, a bristle cell and eight photoreceptors (PRs) R1-R8 2. The PRs have specialized microvillar structures, the rhabdomeres, which contain light-sensitive pigments, the Rhodopsins (Rhs). The rhabdomeres of six PRs (R1-R6) form a trapezoid and contain Rh1 3 4. The rhabdomeres of R7 and R8 are positioned in tandem in the center of the trapezoid and share the same path of light. R7 and R8 PRs stochastically express different combinations of Rhs in two main subtypes5: In the 'p' subtype, Rh3 in pR7s is coupled with Rh5 in pR8s, whereas in the 'y' subtype, Rh4 in yR7s is associated with Rh6 in yR8s 6 7 8.
Early specification of PRs and development of ommatidia begins in the larval eye-antennal imaginal disc, a monolayer of epithelial cells. A wave of differentiation sweeps across the disc9 and initiates the assembly of undifferentiated cells into ommatidia10-11. The 'founder cell' R8 is specified first and recruits R1-6 and then R7 12-14. Subsequently, during pupal development, PR differentiation leads to extensive morphological changes 15, including rhabdomere formation, synaptogenesis and eventually rh expression.
In this protocol, we describe methods for retinal dissections and immunohistochemistry at three defined periods of retina development, which can be applied to address a variety of questions concerning retinal formation and developmental pathways. Here, we use these methods to visualize the stepwise PR differentiation at the single-cell level in whole mount larval, midpupal and adult retinas (Figure 1).

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The Drosophila retina is a crystal-like lattice composed of a small number of cell types that are generated in a stereotyped manner 1. Its amenability to sophisticated genetic analysis allows the study of complex developmental programs. This protocol describes dissections and immunohistochemistry of retinas at three discrete developmental stages, with a focus on photoreceptor differentiation.

La disección e inmunohistoquímica de larva, pupa y adulto<em&gt; Drosophila</em&gt; Retinas

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The serotonergic feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of critical importance during the development of the circuit. Using the functional output of the circuit, feeding, changes in the neuronal architecture of the stomatogastric system can be visualized. Feeding behavior can be recorded by observing the rate of retraction of the mouth hooks, which receive innervation from the brain. Locomotor behavior is used as a physiological control for feeding, since larvae use their mouth hooks to traverse across an agar substrate. Changes in feeding behavior can be correlated with the axonal architecture of the neurites innervating the gut. Using immunohistochemistry it is possible to visualize and quantitate these changes. Improper handling of the larvae during behavior paradigms can alter data as they are very sensitive to manipulations. Proper imaging of the neurite architecture innervating the gut is critical for precise quantitation of number and size of varicosities as well as the extent of branch nodes. Analysis of most circuits allow only for visualization of neurite architecture or behavioral effects; however, this model allows one to correlate the functional output of the circuit with the impairments in neuronal architecture.

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae serves a simple yet powerful model that allows changes in feeding rate to be correlated with alterations in the stomatogastric neural circuitry. This circuit is composed of central serotonergic neurons that send projections to the mouth hooks as well as the foregut.

Análisis funcional del circuito de alimentación de las larvas en Drosophila</i

The serotonergic  feeding circuit in Drosophila  melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of  critical importance during the ...

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given their relevance to development and disease, understanding the mechanisms that govern asymmetric stem cell division has been a robust area of study. Because they are genetically tractable and undergo successive rounds of cell division about once every hour, the stem cells of the Drosophila central nervous system, or neuroblasts, are indispensable models for the study of stem cell division. About 100 neural stem cells are located near the surface of each of the two larval brain lobes, making this model system particularly useful for live imaging microscopy studies. In this work, we review several approaches widely used to visualize stem cell divisions, and we address the relative advantages and disadvantages of those techniques that employ dissociated versus intact brain tissues. We also detail our simplified protocol used to explant whole brains from third instar larvae for live cell imaging and fixed analysis applications.

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

This protocol details a streamlined method used to conduct live cell imaging in the context of an intact larval brain. Live cell imaging approaches are invaluable for the study of asymmetric neural stem cell divisions as well as other neurogenic and developmental processes, consistently uncovering mechanisms that were previously overlooked.

Imágenes en vivo de<em&gt; Drosophila</em&gt; larvales neuroblastos

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...

Acquisition of High-Quality Digital Video of Drosophila Larval and Adult Behaviors from a Lateral Perspective

Drosophila melanogaster is a powerful experimental model system for studying the function of the nervous system. Gene mutations that cause dysfunction of the nervous system often produce viable larvae and adults that have locomotion defective phenotypes that are difficult to adequately describe with text or completely represent with a single photographic image. Current modes of scientific publishing, however, support the submission of digital video media as supplemental material to accompany a manuscript. Here we describe a simple and widely accessible microscopy technique for acquiring high-quality digital video of both Drosophila larval and adult phenotypes from a lateral perspective. Video of larval and adult locomotion from a side-view is advantageous because it allows the observation and analysis of subtle distinctions and variations in aberrant locomotive behaviors. We have successfully used the technique to visualize and quantify aberrant crawling behaviors in third instar larvae, in addition to adult mutant phenotypes and behaviors including grooming.

Acquisition of High-Quality Digital Video of Drosophila Larval and Adult Behaviors from a Lateral Perspective

Here we describe a simple and widely accessible microscopy technique to acquire high-quality digital video of Drosophila adult and larval mutant phenotypes from a lateral perspective.

Adquisición de vídeo de alta calidad digital de<em&gt; Drosophila</em&gt; Comportamientos larvas y adultos desde una perspectiva lateral

Drosophila melanogaster is a powerful experimental model system for studying the function of the nervous system. Gene mutations that cause dysfunction of ...

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral variation. The larval path-length assay was developed to measure individual differences in foraging behavior that were later linked to the foraging gene. Larval path-length is an easily scored trait that facilitates the collection of large sample sizes, at minimal cost, for genetic screens. Here we provide a detailed description of the current protocol for the larval path-length assay first used by Sokolowski. The protocol details how to reproducibly handle test animals, perform the behavioral assay and analyze the data. An example of how the assay can be used to measure behavioral plasticity in response to environmental change, by manipulating feeding environment prior to performing the assay, is also provided. Finally, appropriate test design as well as environmental factors that can modify larval path-length such as food quality, developmental age and day effects are discussed.

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

We provide a detailed protocol for a Drosophila melanogaster foraging path-length assay. We discuss the preparation and handling of test animals, how to perform the assay and analyze the data.

Forrajeo Protocolo Ruta de longitud de<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Las larvas

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral ...

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in communication with the epidermal cells they innervate and thus their analysis benefits from in situ visualization of both neuronally and epidermally expressed proteins by immunofluorescence. Traditional methods of preparing larval fillets for immunofluorescence experiments leave intact the muscle tissue that covers most of the body wall, presenting several challenges to imaging neuronal and epidermal proteins. Here we describe a method for removing muscle tissue from Drosophila larval fillets. This protocol enables imaging of proteins that are otherwise obscured by muscle tissue, improves signal to noise ratio, and facilitates the use of super-resolution microscopy to study da neuron development.

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

Studies of neuronal morphogenesis using Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons benefit from in situ visualization of neuronal and epidermal proteins by immunofluorescence. We describe a procedure that improves immunofluorescence analysis of da neurons and surrounding epidermal cells by removing muscle tissue from the larval body wall.

Eliminación de<em&gt; Drosophila</em&gt; Tejido muscular de larvas Filetes para el análisis de inmunofluorescencia de las neuronas sensoriales y las células epidérmicas

Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in ...