Este protocolo permitió responder a una pregunta importante en el campo de la metástasis del cáncer. Incluyendo, ¿cómo las células tumorales colonizan el pulmón? ¿Cómo permanecen latentes las células tumorales?
Y lo que los induce a salir de la latencia y eventualmente formar metástasis. La principal ventaja de este protocolo es que el proceso metastásico dinámico se puede estudiar directamente in vivo, en tiempo real, en un microambiente real. Este método puede proporcionar información sobre varias enfermedades pulmonares, pero es particularmente útil para comprender el comportamiento de las células tumorales individuales que se diseminan al pulmón, un sitio común de metástasis.
Para empezar, use una sutura de seda 2-0 para atar un nudo en la base de un catéter de calibre 22, dejando colas de 2 pulgadas de largo. Una vez que el ratón esté completamente anestesiado, mueva el ratón a la mesa de operaciones, intuba al ratón y luego asegure el catéter de intubación atando la sutura de seda 2-0 alrededor del hocico del ratón. Conecte el ventilador al catéter de intubación.
Con cinta adhesiva, asegure las extremidades craneales y traseras delanteras caudalmente hasta la etapa quirúrgica calentada. Coloque una cinta de papel a lo largo de la espalda del ratón para maximizar la exposición al campo quirúrgico. Levante la piel con las pinzas y haga una incisión circular de aproximadamente 10 mm a unos 7 mm a la izquierda hasta el esternón y unos 7 mm superior al margen subcostal.
Extirpar el tejido blando que recubre las costillas. Eleve la sexta y séptima costilla usando fórceps. Use una sola hoja de las tijeras de microdisección romas con el lado redondeado hacia el pulmón para perforar cuidadosamente el músculo intercostal entre la sexta y séptima costillas para ingresar al espacio intratorácico.
Descarga delicadamente el bote de aire comprimido en el defecto para colapsar el pulmón y separar el pulmón de la pared torácica. Dispare el aire comprimido en ráfagas cortas para evitar lesiones pulmonares iatrogénicas. Coloque la punción de biopsia sobre la herramienta de corte y maniobre cuidadosamente la base de la herramienta de corte a través de la incisión intercostal.
Oriente la base de la herramienta de corte paralela a la pared torácica y perfore un orificio circular de 5 mm a través de la caja torácica. Usando una sutura de seda 5-O, coloque una puntada de cuerda de bolso, aproximadamente a 1 mm del orificio, circunferencialmente. A continuación, coloque el marco de la ventana en la pared torácica con los bordes del defecto circular capturado dentro de la ranura de las ventanas.
Ate firmemente la sutura de seda 5-O para bloquear de forma segura la ventana implantada. Aplique un flujo constante y suave de aire comprimido durante unos 10 a 20 segundos para secar el pulmón. Use las pinzas para agarrar el marco de la ventana por su borde exterior y levántelo suavemente para garantizar la separación del pulmón de la superficie inferior del marco de la ventana.
Dispense una capa delgada de adhesivo de cianoacrilato a lo largo de la superficie inferior del marco óptico de la ventana. Presione suave pero firmemente el marco de la ventana óptica sobre el tejido pulmonar durante 10 a 20 segundos para la fijación. Dispense una gota de adhesivo de 5 mm en un resbalón de cubierta rectangular.
Utilice la herramienta de recogida al vacío para recoger un deslizamiento de cubierta de 5 mm. Sumerja la superficie inferior del deslizamiento de la cubierta en el adhesivo y luego raspe el exceso de adhesivo tres veces contra el lado del deslizamiento de la cubierta rectangular para hacer que una capa muy delgada de adhesivo en la cubierta se deslice. Coloque cuidadosamente el deslizamiento de la cubierta en un ángulo dentro del hueco en el centro del marco de la ventana óptica, justo encima del tejido pulmonar.
Sujetar brevemente el ventilador para generar presión positiva, hiperinflando el pulmón. Oriente el deslizamiento de la cubierta paralelo al tejido pulmonar, utilizando el movimiento giratorio para crear una deposición directa entre la superficie pulmonar y la superficie inferior del deslizamiento de la cubierta. Mantenga una presión suave durante aproximadamente 25 segundos para ajustar el adhesivo de cianoacrilato.
Separe el deslizamiento de la cubierta de la herramienta de captación al vacío con fórceps. Cree una puntada de cuerda de bolso, circunferencialmente, a menos de 1 mm del borde cortado de la incisión de la piel utilizando sutura de seda 5-O. Coloque cualquier exceso de piel debajo del borde exterior del marco de la ventana antes de atar la ventana con nudos de bloqueo.
Dispense una pequeña cantidad de adhesivo en la interfaz de vidrio metálico para garantizar un sello hermético entre el resbalón de la cubierta y el marco de la ventana. Conecte la aguja estéril a una jeringa de insulina de 1 ml. Inserte la aguja debajo de la apófisis xifoidea, avanzando hacia el hombro izquierdo, entrando en la cavidad torácica a través del diafragma.
Retire suavemente la jeringa para eliminar el aire residual de la cavidad torácica. La imagen intravital multifotónica de una sola región pulmonar mostró que el microvascular podía ser reubicado durante tres días consecutivos. El punto de ramificación definible de un solo buque se identificó cada día consecutivo.
Los eritrocitos no etiquetados crearon sombras cuando fluyen en vasos más grandes. El ángulo de los puntos de ramificación en relación con el vaso se puede utilizar para calcular los caudales de eritrocitos. La velocidad de los eritrocitos también se cuantificó inyectando al ratón microesferas fluorescentes y sus longitudes de pista se midieron divididas por el tiempo de adquisición del marco.
Las microesferas estacionarias y fluidas eran distinguibles. El destino de las células tumorales diseminadas se rastreó con imágenes en serie durante varios días, utilizando la ventana para imágenes de alta resolución del pulmón. La célula tumoral llegó y se alojó en la vasculatura pulmonar el primer día.
Sin embargo, la célula no se detectó en la vasculatura pulmonar en el segundo y tercer día, lo que indica recirculación o extravasación. Los pasos culminantes de la progresión metastásica en el pulmón se visualizaron comenzando con la llegada de la célula tumoral, la extravasación de la célula tumoral en el parénquima pulmonar y la proliferación para formar macro metástasis. Tenga cuidado de evitar traumatismos en el pulmón durante la colocación del marco óptico de la ventana.
El pulmón es propenso al sangrado, lo que más tarde impedirá la adherencia al deslizamiento de la cubierta durante la colocación. Otros métodos que se pueden realizar después de este procedimiento incluyen la microscopía intravital, que cuando se emplea con un enfoque modificado de la microcartografía, permite la relocalización precisa de las áreas de interés para imágenes repetidas. Este protocolo permitió la visualización del pulmón en la investigación de una pregunta clave sobre el mecanismo de la metástasis.
Este estudio tiene el potencial de reconstruir un nuevo tratamiento para pacientes con cáncer.
