Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la enfermedad renal. Particularmente en la comprensión del glomerós en estados normales y enfermos. La biología glomerular puede ser difícil de estudiar debido a la variedad de tipos de células presentes y su estructura única.
La principal ventaja de esta técnica es proporcionar una fuente fácilmente disponible de glomérulos intactos utilizando métodos y equipos simples. Esta técnica tiene implicaciones para nuestra comprensión de la barrera de filtración en el riñón normal y enfermo. En particular, puede arrojar luz sobre nuestra comprensión de la enfermedad renal crónica proteica en la que la lesión glomerular conduce a la secreción anormalmente alta de proteínas séricas en la orina.
Generalmente, los individuos nuevos en esta técnica tendrán dificultades para obtener un rendimiento y pureza adecuados en la muestra final. Demostrando el procedimiento estará Brittney Rush, un técnico de mi laboratorio. Para comenzar, usa cortapelos para eliminar el vello del abdomen anterior de una rata eutanizada.
Use 70%etanol para limpiar la piel expuesta. Luego, usando tijeras quirúrgicas, haga una incisión de línea media en la piel. Para exponer los órganos internos, haga una incisión de línea media a través de la capa muscular.
Localice y aísle los riñones y colóquelos en un tubo cónico de plástico esterilizante de 50 mililitros con 30 mililitros de la solución de sal tamponada de Hank o HBSS colocado en hielo. Transfiera el tubo sobre hielo a una capucha de cultivo celular estéril. Transfiera los riñones a un plato estéril de Petri que contenga cinco mililitros de HBSS colocados sobre hielo.
Use tijeras y fórceps afilados para eliminar y desechar la grasa perirenal. Para extraer y desechar las cápsulas que rodean el riñón, haga una pequeña incisión superficial y luego use fórceps afilados para alejarlo suavemente del riñón. Coloque los riñones en una gasa estéril en un segundo plato de Petri con cinco mililitros de HBSS y divida cada riñón por la mitad a través de una sección media-sagital.
Usa un bisturí para eliminar y descartar la médula que se puede identificar por su color más oscuro y ubicación central. Transfiera las piezas restantes que contengan predominantemente la corteza renal, en un tercer plato de Petri con cinco mililitros de HBSS. Utilice una cuchilla de afeitar estéril para picarlas hasta que las piezas sean de menos de un milímetro de tamaño o hasta que se forme una pasta.
Utilice 1%BSA PBS para mojar la parte superior e inferior de un tamiz de 180 micrómetros sobre un vaso de residuos de 500 mililitros. Este paso es crítico ya que recubre el tamiz con proteína y reduce la adherencia de los glomérulos, lo que mejorará el rendimiento. Coloque la corteza mixta en un pequeño borde del tamiz.
Utilice la brida texturizada del émbolo de una jeringa desechable de 10 mililitros para mush el tejido a través del tamiz en una sartén inferior colocada en hielo. Enjuague periódicamente con HBSS utilizando lo menos posible para evitar la dilución de la muestra y reutilice el líquido que se acumula en la bandeja inferior para enjuagar el tamiz. Después del tamizado completado, lave cuidadosamente la parte inferior del tamiz con HBSS desde la parte inferior de la sartén para capturar cualquier glomérulo ligeramente adherido.
Divida todo el líquido de la bandeja inferior en jeringas de 10 mililitros equipadas con agujas de calibre 20. Pase el líquido a través de la aguja al menos tres veces a la sartén inferior. Para la última tar recopilación, mantenga el líquido que contiene glomérulos en la jeringa hasta que esté listo para pasarlo a través del tamiz de 90 micrómetros.
Mientras tanto, lave la sartén inferior lavándola con 1%BSA PBS y en un vaso de residuos. Utilice 1%BSA PBS para mojar la parte superior e inferior de un tamiz de 90 micrómetros y luego colóquelo en la parte superior de la sartén inferior. Aplique la muestra en las jeringas a un borde del tamiz.
Utilice una brida de émbolo texturizada para mush el tejido a través del tamiz como se hizo anteriormente. Utilice la solución de la sartén inferior para lavar el tejido y recoger todo de un borde del tamiz. Una vez completado el tamizado, lave cuidadosamente la parte inferior del tamiz con tamiz HBSS desde la parte inferior de la sartén para capturar cualquier glomérulo que pueda adherirse libremente.
Recoger todo el líquido de la sartén inferior en un tubo cónico de plástico de 50 mililitros. Utilice 1%BSA PBS para lavar la sartén inferior en un vaso de residuos. Luego usa 1%BSA PBS para mojar la parte superior e inferior de un tamiz de 75 micrómetros.
Coloque el tamiz en la parte superior de la sartén inferior colocada sobre hielo. Aplique la muestra a un borde del tamiz con el líquido que fluye fácilmente. Enjuague la parte superior del tamiz con un mínimo de 20 mililitros de 1%BSA PBS en un vaso de residuos y lave cuidadosamente la parte inferior del tamiz.
Para recoger los glomérulos que permanecieron en la parte superior del tamiz de 75 micrómetros, enjuague a través del tamiz boca abajo con tanto HBSS como sea necesario para recoger glomérulos en un plato de Petri. Recoger los glomérulos tamizados en un tubo cónico de plástico de 50 mililitros sobre hielo. Después de centrifugar a 1800 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados, retire el sobrenadante cuidadosamente usando una pipeta.
Vuelva a suspender el pellet en 10 mililitros de HBSS frío. Combine las muestras y repita la centrifugación. Re-suspenda los glomérulos en cinco mililitros de HBSS.
Para contar el total de glomérulos, coloque una gota de 10 microlitro de la muestra en un portaobjetos de vidrio, cuente bajo un microscopio y múltiplo por 500 para obtener el rendimiento total. Las estructuras aisladas deben consistir en casi todos los glomérulos sin estructuras tubulares. Si los túbulos están presentes y afectarían a la aplicación posterior, se pueden eliminar aplicando toda la muestra al tamiz de 90 micrómetros y repitiendo el protocolo a partir de ese momento.
El protocolo descrito aquí es eficiente en el aislamiento de glomérulos y la suspensión final está densamente llena de glomérulos con una pureza superior al 95% y una contaminación mínima de los segmentos tubulares u otros tipos de células. Estos glomérulos se pueden teñir con manchas de hematoxilina y eosina para ver su morfología. Además, mantienen su estructura en todo el protocolo incluso después del procesamiento.
Retienen podocitos intactos y viables, células mesangiales y células endoteliales. Los glomérulos aislados han estado expuestos a lesiones químicas para simular patología in vivo. Específicamente sulfato de protamina que interrumpe la carga de la barrera de filtración glomerular.
Contrariamente a los glomérulos sanos, los glomérulos tratados con sulfato de protamina tienen una reducción prominente en la nefrona y un número de núcleos positivos para el WT1. Cuando se ve con microscopía electrónica de transmisión, los glomérulos sanos muestran procesos típicos del pie. Después del tratamiento del sulfato de protamina, los procesos del pie son alargados o borrados que indican lesión de podocitos.
Para determinar la viabilidad celular en glomérulos aislados, se observó caspasa tres cortada como un marcador de apoptosis. No había caspasa cortada tres a cero y una hora después del aislamiento de los glomérulos. Algunas células mostraron signos de apoptosis a las dos y cuatro horas con un aumento progresivo con el tiempo.
El mayor número de células apoptóticas se observó en 24 y 48 horas. Sobre la base de estos resultados, recomendamos que los glomérulos aislados se utilicen inmediatamente después del aislamiento para la mayoría de los experimentos. Al realizar este procedimiento, es importante trabajar de forma rápida y eficiente.
Desde el momento en que el riñón está aislado, los glomérulos comienzan a deteriorarse. Cuanto más rápido aísles a los glomérulos, más tiempo tendrás que posar, aislamiento, manipulación. Después del aislamiento, los glomérulos aislados pueden estar expuestos a agentes químicos o biológicos para estimular condiciones fisiológicas o patológicas.
Y las muestras pueden ser procesos para el aislamiento de proteínas o ARN, histología o inmunofluorescencia y microscopía electrónica. Desde su desarrollo en la década de 1950, esta técnica ha ayudado a los investigadores en el estudio de la biología glomerular. En general, este protocolo proporciona un método para evaluar las características morfológicas y celulares de los glomérulos intactos en estados normales y enfermos.
Este método puede ayudar a nuestra comprensión de la enfermedad renal crónica proteica y ayudar en el desarrollo de futuras terapias.
