El objetivo general de este procedimiento, se explica el uso de cisplatino como agente nefrotoxico en peces cebra adultos, analizando la inflamación, y la muerte celular en el tejido renal. Para lograr esto y los peces cebra adultos se anestesian y pesan para inyectar en una dosis específica de cisplatino en la cavidad peritoneal. Después de controlar la mortalidad, el riñón se disecciona y las células están aisladas para la citometría de flujo o fijas y diseccionadas para ser analizadas por ensayo fluorescente TUNEL.
Los siguientes procedimientos pueden ayudar a responder preguntas clave en el campo renal utilizando los efectos nefrotoxicos del cisplatino como herramienta para desarrollar un modelo de lesión renal aguda y peces cebra adultos. Este modelo se puede utilizar para la exploración de nuevas dianas terapéuticas en la protección renal, así como para dilucidar el mecanismo de regeneración en el riñón de pez cebra. Cisplatino es un agente de quimioterapia utilizado para tratar una variedad de cáncer.
Sin embargo, puede acumularse fácilmente en el riñón, generando muerte celular, inflamación y disminuir la función renal. El efecto de cisplatino depende de la dosis, por lo que puede reducir nuestro aumento de la dosificación dependiendo de sus objetivos. Las técnicas utilizadas aquí para analizar la inflamación y la muerte celular no son exclusivamente para la difusión del modelo de enfermedad.
La citometría de flujo en peces cebra puede ayudar a dilucidar los estados inflamatorios del animal de forma cuantitativa, mientras que en TUNEL decimos que puede aclarar la presencia de células pobladas en los contextos fisiológico y patológico. Antes de comenzar el experimento, prepare la solución de trabajo de cisplatino diluyendo la solución de stock a 820 microgramos por mil en cloruro de sodio al 0,9%. A continuación, anestesia otro pez cebra y seca el exceso de agua en algunas toallas de papel.
Pesar el pescado colocándolos en una báscula, tomando nota del peso. Haga los cálculos para conocer el volumen exacto que desea inyectar. Para lograr la dosis de 120 microgramos por gramos de peso, utilice la siguiente fórmula.
Divida la dosis final por la dosis de la solución de trabajo y convierta este número en microlitros, multiplicándose por 1000 para obtener el volumen de 120 microgramos de cisplatino. A continuación, multiplique este número por el peso de los peces para obtener el volumen final que se va a inyectar. Coloque un pez sobre una esponja húmeda, con una taza pequeña para sostenerlo.
Con el lado ventral hacia arriba y llenar una jeringa de insulina con un volumen calculado de cisplatino. Inserte la aguja en la línea media ventral en un ángulo poco profundo, tirando suavemente de la pared ventral hacia arriba para evitar perforar los órganos internos. Y luego inyectar la solución.
Después de la inyección, coloque un pez en un tanque para recuperarse de la anestesia, y espere a signos de recuperación como nadar y movimientos apropiados. Monitoree para que los peces dos veces al día para los próximos días. A esta dosis, la cisplatino induce alrededor del 30% de la mortalidad en las primeras 24 horas.
Eutanasia los peces y seca el exceso de agua en una toalla de papel. Después de extraer la cabeza y los órganos internos, utilice agujas de disección para fijar las paredes del cuerpo. Localice el riñón en la pared dorsal del pez y use fórceps para separar el riñón.
Coloque el riñón en una placa de seis pozos con una solución fría de un PBS 1X, 2% FBS y manténgalo en hielo. A continuación, recoja el tejido con un poco de líquido y páselo a través de un colador de células de 40 micras, y macere suavemente el tejido con un émbolo de jeringa. Lave dos veces con un PBS 1X, 2% FBS.
Y recoger las células en un tubo de halcón de 50 mils. A continuación, centrífuga durante cinco minutos a 400 G.Careful recoger el sobrenadante con una pipeta y desecharlo. Agregue 500 microlitros de PBS frío 1X para volver a suspender las células y colocarlas en un tubo de citometría de flujo de cinco mils.
Mantenlos en hielo. Tome 10 microlitros de la muestra y mézclala con 90 microlitros de color azul tripán en un tubo Eppendorf. Añadir 10 microlitros de la mezcla a una cámara Neobauer y contar células en el microscopio.
Tome las celdas para ser leídas por un cytometer y luego analice los resultados seleccionando la población de sus intereses. Para este procedimiento, eutanasia un pez y elimina los órganos internos que dejan el riñón unido al cuerpo. A continuación, ancle las paredes del cuerpo a una superficie de corcho y colóquela gradualmente sobre la solución de fijación.
Mantenlo a cuatro grados durante la noche. Al día siguiente, disecciona el riñón con la cep fina. Trata de no interrumpirlo.
Colóquelo en una pequeña placa de Petri o en un tubo Eppendorf con 1X PBS para enjuagar. Cambie el PBS y prepare el 2% de agarose para generar una matriz de soporte para el riñón antes de procesarlo sólidamente. Deseche todos los PBS restantes y vierta la agarose lentamente.
A continuación, coloque el riñón con fórceps finos para evitar que se doble. Deje que la agarose se solidifique a temperatura ambiente. Después de la solidificación de la agarose, use un bisturí para cortar Agarose alrededor de los riñones formando un cubo pequeño.
Coloque los cubos de agarose dentro de un casete histológico y envíelo para su procesamiento histológico para incrustar el tejido en la parafina. Los bloques de parafina, luego cortaremos en cinco secciones de espesor de micras. Descerar se desliza y mantenerlos en agua destilada.
Prepare una cámara de incubadora oscura, poniendo toallas de papel mojado en la parte inferior. Coloque las diapositivas en la cámara oscura y agregue Proteinase K para la permeabilización del tejido. Incubar durante 30 minutos a 37 grados centígrados.
Mientras se incuban muestras, prepare la mezcla de reacción TUNEL, añadiendo 50 microlitros de solución enzimática en 450 microlitros de solución de etiquetas. Y mantenerse protegido de la luz. Coge la cámara oscura y lava la rebanada dos veces con un PBS 1X.
A continuación, seque los toboganes y sobre la mezcla de reacción TUNEL. E incubar a 37 grados centígrados durante dos horas. Después de la incubación, lave estas diapositivas de nuevo con un PBS 1X.
Y agregue DAPI para la tinción del contador de núcleos. Incubación a temperatura ambiente durante cinco minutos, protegida de la luz. Enjuague tres veces con un PBS 1X.
Y luego, moldear las diapositivas con un medio hidrófilo anti-fundido. Coloque un resbalón de cubierta. Y sellar con esmalte de uñas.
Visualice las muestras en un microscopio fluorescente. En este gráfico, es posible ver que la cisplatino tiene un efecto de respuesta de dosis sobre la supervivencia de los peces, en comparación con un control inyectado sólo con cloruro de sodio al 0,9%. La línea roja en este gráfico representa una dosis de 120 microgramos por gramos utilizados en este video.
Esta dosis se puede aplicar a hombres y mujeres, ya que no se encontró ninguna diferencia estadística entre ellos. La citometría de flujo permite cuantificar diferentes células presentes en un tejido. Las poblaciones de células hematopoyéticas se identifican en el riñón de varios peces por tamaño o dispersión hacia adelante y dispersión de granularidad o tamaño.
De esta manera, es posible separar las poblaciones en eritrocitos, linfocitos, granulocitos y precursores hematopoyéticos. Aquí, la estrategia actual de la puerta que selecciona los granulocitos, singletes y células positivas MPO permite encontrar la población de los neutrófilos en el riñón marcado por la expresión de fluorescencia de la mieloperoxidasa. En este caso, la inyección de cisplatino indujo el aumento en el porcentaje de neutrófilos presentes en el riñón.
El ensayo TUNEL permite detectar células apoptóticas en un tejido observando la caída del tejido del riñón por un microscopio de fluorescencia, es posible ver una señal apoptótica dentro de los núcleos de algunas células, aquí en rojo. Contrastado por una mancha nuclear en un DAPI de este tipo aquí en azul. Inyección de cisplatino aumentó la presencia de células apoptóticas en el riñón, que son posibles de cuantificar manualmente o utilizando un software de imagen.
Al final de este video usted debe ser capaz de saber cómo inyectar y ajustar la dosis de cisplatino para inducir lesiones renales agudas en peces cebra adultos. Y cómo diseccionar el riñón para diferentes propósitos. La citometría de flujo es una excelente herramienta que le ayudará a entender el perfil de diferentes tipos de células dependientes de la disponibilidad de líneas de tragenclave en su laboratorio.
Recuerde considerar el color de las líneas de transportadores si desea utilizar anticuerpos para etiquetar todos sus tipos de celdas. El ensayo TUNEL es una herramienta sencilla que nos permite detectar células y tejidos apoptóticos, y puede ser analizado no sólo por microscopía, sino también por citometría de flujo. Recuerde, utilice siempre equipos de protección personal durante todo el procedimiento.
