Nuestro laboratorio en Johns Hopkins ha estado realizando pequeños trasplantes de riñón e hígado de animales con más de dos décadas de experiencia. Este protocolo específico describe los pasos críticos que son necesarios para realizar con éxito el trasplante ortotópico de riñón en ratas. Para aumentar la probabilidad y reproducibilidad del éxito, nuestro protocolo incluye tres pasos distintivos, perfusión del riñón del donante a través de la vena porta y el uso de un sistema de manguito para anastomose las venas renales y uréteres.
Demostrar este procedimiento será el Dr.Le Qi, un estudiante graduado en nuestro laboratorio. Para comenzar este procedimiento, anestesar la rata donante como se describe en el protocolo de texto. Coloque la rata en una posición supina e inmovilice las extremidades con cinta adhesiva estéril.
Aplique un lubricante para los ojos y esterilice el campo quirúrgico como se describe en el protocolo de texto. Antes de la primera incisión, asegúrese de que la rata esté adecuadamente anestesiada comprobando la ausencia del reflejo de abstinencia de pellizco del dedo del dedo. Usando tijeras, comienza haciendo una gran incisión longitudinal de la línea media y el músculo desde la sínfisis pubis hasta el xifoide y entra en la cavidad peritoneal.
Cubra el intestino con una gasa estéril húmeda y descúbrala hacia el lado lateral derecho del abdomen exponiendo la aorta, la vena cava y el riñón izquierdo. Aplicar un mililitro de solución salina precalentada con una jeringa de un cc para mantener los intestinos y los órganos abdominales húmedos y a una temperatura normal. Aplica una segunda gasa húmeda para cubrir y movilizar el estómago y el bazo craneal al riñón.
Luego agrega una pequeña gasa húmeda para cubrir el riñón expuesto. Utilice fórceps diseccionador microquirúrgicos para aislar y movilizar la arteria renal izquierda y la vena del tejido conectivo y entre sí. Ahora aísle la vena renal izquierda cauterizando la vena gonadal izquierda y aísle la arteria renal izquierda cauterizando la arteria suprarrenal.
Después de eso, movilizar la aorta y la vena cava superior e inferior al pediculo renal izquierdo diseccionando el tejido conectivo con fórceps diseccionantes. Divida y movilice el uréter del tejido conectivo usando fórceps diseccionados, luego use micro tijeras para hacer una incisión diagonal a una longitud de aproximadamente dos centímetros medida desde la pelvis renal. Inserte un brazalete de poliamida hasta la mitad en el uréter y fije el brazalete colocando un nudo con 8-0 sutura de seda.
Movilizar el riñón izquierdo separándolo de la grasa perineférica usando fórceps diseccionantes o micro tijeras. Deje la cápsula adiposa del riñón unida y use ese sitio para manejar el riñón. Ahora administre 200 unidades de heparina utilizando una jeringa con una aguja de calibre 27 a través de la vena del pene.
Presione el lugar de la inyección con un hisopo de algodón durante al menos un minuto para evitar el sangrado. Identificar la vena porta y la vena cava inferior. Exponer la vena cava inferior.
Prepárese para lavar el riñón inyectando 50 mililitros de solución salina fría mezcladas con 500 unidades de heparina en la vena porta utilizando una aguja de calibre 16. Antes de enjuagar, cortar la vena cava inferior a nivel infrahepático y cortar el caudal de la vena porta en el sitio de inserción de la aguja para permitir que la sangre salga de la circulación. Comience a lavar el riñón infundiendo gradualmente la solución salina.
Observe un cambio de color del riñón de rojo oscuro a un color gris uniforme o pálido. Después del enrojecimiento, ligar la arteria renal y la vena proximal a la aorta y vena cava. Coloque el riñón enrojecido en un plato de Petri que contenga solución salina fría sobre hielo antes de extraer el cuerpo del donante del campo quirúrgico.
Una vez que el riñón está en solución salina fría, fijar e inmovilizar el mango del manguito de la vena y tirar suavemente de la vena renal a través del manguito. A continuación, fije la vena renal sobre el brazalete colocando tres nudos usando 8-0 sutura de seda. Para comenzar el procedimiento de receptor, repita los pasos desde el procedimiento del donante hasta la administración de heparina.
A continuación, coloque dos abrazaderas de microcuenta araumática en la arteria renal izquierda y la vena proximal en la aorta y la vena cava. Ligar la vena renal proximal receptora a la entrada del riñón. Enjuague la vena renal con solución salina heparinizada para eliminar toda la sangre restante del vaso.
Deslice la vena renal ligada sobre la vena renal esposada previamente colocada en el riñón del donante. A continuación, asegure la vena con un 8-0 sutura de seda. Mantenga la misma orientación posicional al asegurar la vena renal sobre el manguito.
Ligar la arteria renal proximal a la entrada del riñón receptor. Láveselo con solución salina heparinizada para eliminar cualquier exceso de sangre en el vaso. Ahora liga el uréter a nivel del polo inferior del riñón izquierdo.
Movilizar el riñón de la grasa perineférica y eliminar el riñón nativo. Realizar una anastomosis de extremo a extremo de la arteria renal con 8-10 suturas interrumpidas usando una sutura de nylon 10-0. Maniobra la arteria usando la capa adventitial.
Retire las abrazaderas del recipiente para volver a iniciar la reperfusión del riñón. Comience quitando la abrazadera en la vena seguida de la abrazadera en la arteria. Use un hisopo de algodón estéril para agregar presión ligera a las áreas que rezuman alrededor de la región de la anastomosis.
Unos minutos deben ser suficientes para lograr una anastomosis de patente. Observe brevemente el riñón para evaluar la perfusión adecuada. Inmediatamente después de la reperfusión, el riñón debe cambiar de color y recuperar gradualmente su color rojo oscuro natural después de unos minutos.
A veces se observa peristalsis visible del uréter y la producción de orina in situ. Termine insertando la punta expuesta del manguito ureteral en el uréter receptor y asegure el uréter receptor con un 8-0 corbata de seda. Para mantener el donante y los uréteres receptores en posición, ate los extremos de cada lado del uréter entre sí.
Opcionalmente, nefrrectice el riñón derecho atando el pediculo renal con una sutura de seda 3-0. Retire todas las gasas de la cavidad abdominal y devuelva todos los órganos a su posición natural. Luego squirt un mililitro de solución salina sobre los intestinos para mantenerlos húmedos.
Cierre el abdomen usando una sutura absorbible 4-0 en el músculo recto y una sutura de seda 4-0 para cerrar la capa de la piel de una manera interrumpida. Coloque al animal en una jaula limpia con acceso al agua y los alimentos ad libitum y permita la recuperación en una almohadilla de calentamiento de 37 grados Celsius. Observar la recuperación durante una o dos horas antes de devolver el animal a la instalación del animal.
Los animales con un trasplante de riñón singéneo lograron una supervivencia a largo plazo sin ningún tratamiento inmunosupresor. Por el contrario, los animales que recibieron trasplante renal alogénico sin inmunosupresión rechazaron su injerto y sucumbieron a la insuficiencia renal con una mediana de supervivencia de ocho días. La creatinina sérica media aumentó modestamente en el grupo singéneo, mientras que aumentó 14 veces en el grupo alogénico.
Tras la explantación, la visión macroscópica del alaógrafo renal singéneo no mostró ninguna anomalía. El color del riñón y las estructuras internas permanecieron intactos. Por el contrario, los alogramas renales de animales rechazados presentaron parches hemorrágicos rojos con la destrucción de las estructuras internas.
Las manchas de hematoxilina y eosina de injertos singéneos mostraron bucles capilares glomerulares delgados con un número normal de células endoteliales y mesangiales. Los alógrafos rechazados mostraban estructuras glomerulares destruidas con signos de inflamación y tubulitis. Se realizó una tinción positiva cd8 para confirmar el rechazo mediado por la célula T.
Mientras que los alografías singéneas mostraron muy pocas células T positivas CD8, los aloógrafos rechazados mostraron un número significativamente mayor de células positivas CD8 en y alrededor de los glomérulos y tubuli confirmando el rechazo mediado de la célula T. Este modelo proporciona una visión significativa de los fenómenos inmunológicos de rechazo, tolerancia e interacciones donante-huésped que allanan el camino para el desarrollo de intervenciones clínicas terapéuticas en el trasplante de órganos sólidos.
