Este método puede ayudar a abordar preguntas importantes en el campo cardiovascular sobre el impacto que tiene la matriz extracelular durante las diferentes etapas fisiológicas y de desarrollo del corazón. La principal ventaja de esta técnica es que permite un análisis comparativo entre matrices extracelulares fetales y adultas mediante la aplicación de un método de descelularización similar a ambos tipos de tejido. Así que este método se ha aplicado con éxito a otros órganos como resección quirúrgica de pacientes con cáncer facilitando el estudio de la matriz extracelular en diferentes contextos.
Comience enjuagando brevemente los corazones de ratón fetal y adulto con PBS helado. A continuación, coloque los tejidos debajo de un microscopio de disección y use tijeras pequeñas rectas para eliminar las aurículas, el ventrículo derecho y el septo de los corazones adultos del ratón. Transfiera el ventrículo izquierdo a un nuevo plato de Petri y divida la pared libre del ventrículo izquierdo en tiras longitudinales de dos milímetros de espesor.
El uso de explantes de ventrículo izquierdo de ratón adulto de un tamaño homogéneo es esencial para una eficiencia de descelularización consistente. Usa el bisturí y las pinzas serradas con punta curvada para eliminar el músculo papilar antes de usar una rejilla de dos por dos milímetros para picar aún más las tiras en fragmentos de tejido más pequeños. Cuando todo el tejido haya sido picado, enjuague brevemente las piezas con suficiente PBS para cubrir los explantes.
Y transfiera los corazones fetales y los trozos de tejido cardíaco adulto a tubos individuales de microcentrífuga de 1,5 mililitros que contengan 250 microlitros de temperatura de corte óptima o compuesto OCT por tubo. Luego, congele las muestras de tejido cardíaco en isopentano enfriado con hielo seco para almacenarlas a 80 grados Celsius negativos. Para decelularizar los tejidos crio-conservados colocar las muestras congeladas en un plato de Petri que contiene suficiente PBS para cubrir completamente los explantes.
Después de que el PTU se haya derretido, sumerja las muestras en un nuevo plato Petri de PBS y lave las muestras tres veces en una coctelera durante 10 a 15 minutos a 60 RPM por lavado. Después del último lavado, agregue un mililitro de tampón hipotónico de trabajo a cada pocólite de una placa de cultivo de tejido estéril de 24 pocillos y use fórceps finos para transferir un fragmento a cada pozo. Incubar la placa a 25 grados centígrados durante 18 horas, a 165 RPM seguidas de tres lavados de una hora en un mililitro de PBS por pozo, por lavado.
Después del último lavado, agregue un mililitro de dodecil sulfato de sodio recién preparado o solución SDS a cada pozo para una incubación de 24 horas a 25 grados centígrados. Al día siguiente, enjuague las muestras con tres lavados de 20 minutos en un mililitro de tampón de lavado hipotónico por lavado seguido de la adición de un mililitro de solución de tratamiento DNase a cada pozo para una incubación de tres horas, a 37 grados Centígrados. Al final de la incubación, las muestras decellularizadas deben perder su consistencia similar a la gelatina.
A continuación, lave los fragmentos de tejido tres veces con un mililitro de PBS durante 20 minutos por lavado seguido de un lavado nocturno en un mililitro de PBS fresco por pozo a temperatura ambiente y 60 RPM. Para evaluar la eliminación de restos celulares del tejido descelularizado, a la mañana siguiente fijar las muestras en un mililitro de tampón neutro fórmula 10% recién preparado complementado con 0.03%de eosina acuosa por pozo para 2.5 a tres horas a temperatura ambiente. Al final de la incubación, lave las muestras en un mililitro de PBS por pocero.
Y utilice un molde de muestra de vinilo desechable para encapsular los fragmentos decellularizados en el gel de procesamiento histológico de acuerdo con las especificaciones del fabricante. A continuación, transfiera los fragmentos encapsulados a un casete de incrustación de procesamiento de biopsia. Y procesar las muestras para la incrustación de parafina a través de sucesivas incubaciones de 30 minutos en concentraciones ascendentes de etanol, solución de hidrocarburo alifático isoparaffínico y dos 56 grados Celsius parafina emergens.
Después del segundo emergente de parafina, monte las muestras en un bloque de parafina y use un microtoma para obtener secciones de tres micrómetros de espesor. A continuación, verifique la eficiencia de la descelularización manchando las secciones con hematoxilina y eosina y las manchas tricromáticas de Masson de acuerdo con los protocolos estándar. Después del lavado nocturno de PBS con agitación, añadir 500 microlitros de DPBS recién preparado, complementado con 2,5 microgramos por mililitro de anfotericina B 1% solución antibiótica a cada andamio.
Y guarde las muestras de uno a siete días a cuatro grados centígrados. Antes de colocar las células, sustituya la solución DPBS por 500 microlitros de medio basal celular complementados con antibióticos. Y incubar los andamios durante una hora a 37 grados centígrados.
Al final de la incubación, utilice un microscopio para agregar una gota de cuatro microlitros de DPBS al centro de un pozo de una placa de 96 pocillos por andamio. Y usa pinzas rectas delgadas para transferir un andamio decellularizado a la parte superior de cada gota. Retire cualquier DPBS adicional por aspiración y confirme que el andamio no está plegado o arrugado.
Cuando los andamios se hayan secado en los bordes, sienta lentamente una suspensión de una sola célula de las células de interés en la parte superior de cada andamio. Los tejidos descelularizados del día 18 embrionarios se caracterizan por una estructura altamente translúcida, mientras que los explantes adultos exhiben un aspecto translúcido a blanco. Las manchas de hematoxilina y eosina y tricomas de Masson confirman una eliminación celular eficiente por la presencia de malla porosa.
El material nuclear se reduce aproximadamente un 99,8% después de la descelularización, en comparación con los tejidos no manipulados, lo que es esencial para evitar desencadenar una respuesta inflamatoria no deseada tras la implantación. La viabilidad celular dentro de los andamios sentados se puede controlar durante el cultivo in vitro mediante tinción de calceína. El análisis terminal de la repoblación celular y la distribución a través de andamios, también se puede realizar después del procesamiento de parafina como se observa en estas imágenes representativas de una sección de biosaminosos centrales.
Así que esta técnica allanó el camino para los investigadores en la exploración de las propiedades bioactivas de la matriz extracelular a partir de corazones de ratón fetales y adultos, pero también de otros tejidos.
