Los autores agradecen a la Wake Forest Institute de Medicina Regenerativa por su ayuda en el desarrollo de este protocolo. Reconocemos el apoyo de subvenciones de la caridad Hospital Great Ormond Street, la Fundación Eugenio Litta (Ginebra, Suiza), el Consejo de Investigación Médica, el Colegio Real de Cirujanos de Inglaterra, de las Sparks Médico Infantil Caridad, la Oficina de Relaciones Exteriores británica para el Reino Unido / EE.UU. Células Madre Premio Colaboración y el Fondo de Investigación de Mittal. También nos gustaría dar las gracias a la Fundación Real Sociedad / Wolfson para la concesión remodelación del laboratorio de ingeniería de tejidos obtenidos por el Departamento de Cirugía Pediátrica en el Instituto de Salud Infantil. PDC y SE son apoyados por la Caridad del Great Ormond Street Hospital de Niños.

1. Aislamiento de rata Intestino <ol><li> Preparar una solución de 1 L de tampón fosfato salino (Sigma, Reino Unido) con 1% de antibiótico / antimicótico (Sigma, Reino Unido) (PBS / AA). Montar la bomba peristáltica (Masterflex L / S de velocidad variable) con dos tubos. Ejecutar etanol al 70% (EtOH) a través de los tubos de la bomba peristáltica durante 15 min a la velocidad máxima, seguido de PBS / AA durante otros 15 min. </li><li> La eutanasia a ratas adultas Sprague-Dawley con un peso de aproximadamente 250 a 350 g por inhalación de CO2 y dislocación cervical de acuerdo con las directrices locales de animales y aprobaciones (en el Reino Unido, las directrices del Ministerio del Interior en virtud de los Animales (Procedimientos Científicos) de la Ley de 1986). </li><li> Autoclave los instrumentos quirúrgicos antes de su uso. Rocíe y limpie el abdomen del animal, utilizando 70% de EtOH. </li><li> Realice una incisión de laparotomía-xifo púbico en el abdomen para asegurar un campo quirúrgico claro. </li><li> Eviscerar el intestino delgado en el lado derecho del animal sobre una toalla de papel rociado con 70% de EtOH. Take cuidado para humedecer continuamente el intestino con PBS / AA con el fin de evitar la deshidratación del tejido y la desnaturalización de la matriz extracelular (ECM). </li><li> Localice la arteria mesentérica superior (AMS) que surjan en un ángulo de 90 ° desde la aorta hacia el intestino. Utilice un G cánula 27 para entrar en el SMA de la aorta y rápidamente retirar la aguja para evitar que se rompa la pared del vaso. Avanzar el tubo de plástico de la cánula en la SMA y asegurar el uso de suturas (Vicryl 5/0). </li><li> Confirmar la canulación mediante la inyección de 1 ml de PBS / AA. Utilice tijeras de primavera para incidir la aorta proximal y distal a la SMA a fin de liberar la cánula. </li><li> Para evitar la fuga de heces cuando la disección de la intestino grueso, colocar uno (seda 5/0) nudo de sutura en el extremo proximal de la unión ileocecal y uno en el extremo distal del colon sigmoide. A continuación, cortar el íleon terminal y del colon entre los dos nudos y quitar el intestino grueso. </li><li> Cortar el intestino en el yeyuno-duodenal cruce unnd liberar al intestino de cualquier conexión del tejido conectivo que puede tener con el abdomen. </li><li> Transferir el intestino delgado en una placa de Petri con PBS / AA. Canular la sección proximal del intestino con una pipeta Pasteur de plástico (LSL Artículos de laboratorio) y seguro en su lugar con puntos de sutura. Cortar la pipeta para que se ajuste el Luer-Lok de una jeringa de 60 ml (BD Plastipak). Enjuague el lumen intestinal 2x con 60 ml de PBS / AA para eliminar las heces y desechos. </li></ol> 2. Metodología Descelularización <ol><li> Conectar la cánula vascular para una llave de paso de tres vías. Esto facilitará la manipulación, reducir al mínimo la tensión en el árbol vascular y permitir la eliminación de las burbujas de la tubería. </li><li> Empieza a correr el agua desionizada (resistividad 18,2 MΩ / cm) a través de la bomba de rodillos de velocidad variable Masterflex L / S a 0,6 ml / hr. Asegúrese de que no hay burbujas en la tubería antes de conectar con la llave de paso de la luz intestinal. Algunas burbujas pueden estar presentes dentro de la luz de la etapa1.9, lo que puede poner en peligro el proceso de descelularización. Variar la velocidad de la bomba y manejar el tejido con unas pinzas cuidadosamente para asegurar la salida de burbujas desde el extremo distal. No conecte la cánula vascular hasta que finalice este proceso ya que las altas velocidades pueden dañar el árbol vascular. </li><li> Transferencia aparato a la sala fría, puesto que el siguiente paso de descelularización se realiza a 4 ° C. La baja temperatura permite la eliminación de las células, reduciendo al mínimo la descomposición del tejido. Coloque la placa de Petri en un contenedor que recogerá la solución desborda. Perfundir tanto el lumen intestinal y el árbol vascular con agua desionizada (resistividad de 18,2 MΩ / cm) durante 24 horas a 0,6 ml / h. Durante la primera hora compruebe el aparato con regularidad para asegurarse de que todas las conexiones son seguras, la fuga es mínimo y no hay burbujas están presentes en el intestino. </li><li> Después de 24 horas de tratamiento con agua desionizada, mueva el aparato descelularización fuera de la sala fría como el resto de los pasos sonllevado a cabo de la temperatura ambiente (TA). </li><li> Pesar desoxicolato de sodio (Sigma, Reino Unido) para preparar 300 ml de una solución al 4% en agua desionizada. Pesar desoxicolato de sodio bajo una campana de aspiración, ya que es un irritante oral y ocular. Mezclar utilizando un vórtice hasta que la solución es clara. La solución puede mantenerse a 4 ° C durante hasta 1 mes. </li><li> Cambie la solución desionizada para desoxicolato de sodio, compruebe las conexiones, eliminar las burbujas y perfundir a 0,6 ml / hora durante 4 horas. </li><li> Después de la etapa de lavado desoxicolato de sodio con PBS / AA para 30 min para evitar la interacción entre el desoxicolato de sodio y DNasa-I. </li><li> Pesar desoxirribonucleasa I (ADNasa-I, Sigma) y preparar 250 ml de una solución 2,000 kU en cloruro de sodio 1 M, pH 7,4. Mezclar utilizando un vórtice hasta que la solución es clara. Esta solución debe prepararse inmediatamente antes de su uso y no se puede almacenar. </li><li> Perfundir con DNasa-I durante 3 horas a temperatura ambiente a una velocidad de 0,6 ml / h. </li><li> Después de la etapa de DNasa-I, transferir elandamio en una campana de cultivo de tejido y cambiar placas e instrumentos. Se sugiere utilizar una técnica aséptica. </li><li> Lavar con PBS / AA durante 30 minutos para asegurarse de que se eliminan todos los restos de las soluciones Descelularización. Coloque el andamio en una nueva placa de Petri y la transferencia a un agente de reticulación UV (Spectroline, EE.UU.). Ejecutar dos ciclos de esterilización. Almacenar en 5% PBS / AA y cambiar la solución cada 3 días. </li></ol>

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Thorac. Cardiov. Surg. 128 (4), 638-641 (2004).</li><li>Elliott, M. J., de Coppi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem-cell-based,+tissue+engineered+tracheal+replacement+in+a+child:+a+2-year+follow-up+study.">Stem-cell-based, tissue engineered tracheal replacement in a child: a 2-year follow-up study.</a> Lancet. 380 (9846), 994-1000 (2012).</li><li>Grikscheit, T. C., Siddique, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+small+intestine+improves+recovery+after+massive+small+bowel+resection.">Tissue-engineered small intestine improves recovery after massive small bowel resection.</a> Ann. Surg. 240 (5), 748-754 (2004).</li><li>Sala, F. G., Matthews, J. A., Speer, A. L., Torashima, Y., Barthel, E. R., Grikscheit, T. 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E., Price, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+and+recellularization+of+whole+livers.">Decellularization and recellularization of whole livers.</a> J. Vis. Exp. (48), e2394 (2011).</li><li>Petersen, T. H., Calle, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-Engineered+Lungs+for+in+Vivo+Implantation.">Tissue-Engineered Lungs for in Vivo Implantation.</a> Science. 329 (5991), 538-541 (2010).</li><li>Ott, H. C., Clippinger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+and+orthotopic+transplantation+of+a+bioartificial+lung.">Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung.</a> Nat. Med. 16 (8), 927-933 (2010).</li><li>Calle, E. A., Petersen, T. H., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedure+for+lung+engineering.">Procedure for lung engineering.</a> J. Vis. Exp. (49), e2651 (2011).</li><li>Totonelli, G., Maghsoudlou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rat+decellularized+small+bowel+scaffold+that+preserves+villus-crypt+architecture+for+intestinal+regeneration.">A rat decellularized small bowel scaffold that preserves villus-crypt architecture for intestinal regeneration.</a> Biomaterials. 33 (12), 3401-3410 (2012).</li><li>Sala, F. G., Kunisaki, S. M., Ochoa, E. R., Vacanti, J., Grikscheit, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+small+intestine+and+stomach+form+from+autologous+tissue+in+a+preclinical+large+animal+model.">Tissue-engineered small intestine and stomach form from autologous tissue in a preclinical large animal model.</a> J. Surg. Res. 156 (2), 205-212 (2009).</li><li>Demirbilek, S., Kanmaz, T., Ozardali, I., Edali, M. N., Y&#252;cesan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+porcine+small+intestinal+submucosa+in+intestinal+regeneration.">Using porcine small intestinal submucosa in intestinal regeneration.</a> Pediatr. Surg. Int. 19 (8), 588-592 (2003).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Los pasos más difíciles en la creación de este experimento implican la canulación de la SMA y el establecimiento y mantenimiento de la esterilidad. Canulación de la SMA en roedores sin romper la pared puede ser bastante difícil debido al tamaño y posición de la embarcación. Alternativamente, una sutura puede ser colocado alrededor de la aorta proximal antes de la SMA origen, seguido de la canulación de la aorta sí mismo distalmente, la dirección de la cánula de plástico en el SMA. Durante descelularización una combinación de una mala colocación de la cánula y las altas tasas de flujo puede resultar en la pérdida del acceso vascular. La esterilidad es un problema importante debido a la cantidad de la flora bacteriana presente en el intestino delgado. Lavado con PBS / AA después de la cosecha es muy importante, y cualquier signo de la materia fecal o desechos debe ser retirado desde el lumen. La colocación de una porción del andamio en un tubo Falcon con DMEM en la incubadora después de la esterilización UV debe ser un indicador de si la esterilidad se ha logrado. En el casode la colonización bacteriana, los medios de comunicación va a cambiar el pH, con su color cambiante de rojo a amarillo. Para hacer frente a esto, más ciclos de UV se aconseja, así como el lavado con PBS que contiene una alta concentración de antibiótico / antimicótico. Una posible modificación para obtener un andamio con acceso tanto vascular y venosa sería para canular la vena cava inferior (IVC), así como la SMA. Descelularización de los lados venosos y vasculares debe intentarse intermitentemente para todas las tres soluciones. Descelularización continua puede explotar en los capilares por tener presión positiva en ambos lados. A través de los años ha habido un número de esfuerzos en intestinal TE utilizando diferentes combinaciones de células-andamiaje in vitro e in vivo 6,9,12. La mayor parte del trabajo se ha realizado utilizando tubulares no tejido 95% PGA-5% de PLGA andamios recubiertos con colágeno de tipo I 6,7,13,22. Después de la siembra con intestinalunidades epiteliales organoides (OU) y un período de implantación en el omento de ratones, que forman quistes con el músculo en el exterior y el epitelio en el interior que luego pueden ser tubulariza. Sin embargo, la porosidad y la simplicidad en el diseño de estos andamios no permite para la generación de grandes trozos de intestino artificial en un entorno in vitro, tales como la de un biorreactor. Además, la falta de una red vascular innata que se puede conectar al destinatario limita aún más el uso de este andamio para la traducción clínica. Además de los experimentos con los andamios de PGA-PLGA, otros grupos han utilizado colágeno o SIS andamios, ambos de los cuales no se replican la complejidad del tracto intestinal. SIS, en particular, es la única metodología anteriormente publicada de la ingeniería de tejidos intestinal y se ha usado en más de 150 entornos médicos, que demuestra la capacidad de los andamios descelularizados para proporcionar estabilidad mecánica y promover el crecimiento celular, mientras que el plomoING ninguna respuesta inmunogénica. Sin embargo, la falta de micro-arquitectura de macro-y apropiado, ha dado lugar a malos resultados en su &quot;uso con fines TE intestinales 9-11,23. Los beneficios de la metodología descelularización hemos descritos incluyen la preservación de las características microscópicas, tales como la arquitectura de las criptas-vellosidades luminal que representan un ambiente apropiado para la repoblación por el nicho de células madre intestinales. En el aspecto macroscópico, la presencia de una red vascular jerárquico será permitir la fijación al receptor, lo que permite el suministro de nutrientes y oxígeno a todas las capas de la TE-delgado 21. Lo que es más, el mantenimiento de componentes de ECM, tales como el colágeno, la elastina y glyocosaminoglycans tiene un papel importante no sólo para las características mecánicas, sino también dirigir la proliferación y diferenciación celular. Lo más importante, la capacidad de la metodología de descelularización a ser ampliado en grantejidos r mientras que el mantenimiento de las mismas características es una característica importante para la traducción clínica de la TE. El desarrollo de una matriz intestinal natural con una red vascular permite la creación de segmentos más grandes de intestino artificial que puede ser conectado al host.

La ingeniería de tejidos (TE) es una alternativa terapéutica para el transplante de órganos, pasando por alto los problemas de inmunosupresión y la escasez de órganos. TE ha tenido recientemente aplicaciones exitosas en la clínica, con el reemplazo de órganos como la vejiga 1, 2 uretra y la tráquea, tanto en los adultos y los niños 3,4 5. La construcción de un órgano por ingeniería de tejidos requiere la combinación de un andamio con las células apropiadas. Un andamio se puede preparar usando de origen natural (por ejemplo, colágeno) y (por ejemplo, ácido poli-L-glicólico; PLGA) sintético materiales, o ser obtenida por el descelularización de órganos y tejidos nativos. Los andamios que se han utilizado hasta ahora para TE intestinal han sido principalmente ya sea descelularizado (submucosa del intestino delgado) o sintético (ácido poli-L-glicólico y ácido poli-láctico) 6-13. Estos biomateriales son muy simples, tanto en la arquitectura micro-macro y, quepuede no ser ideal si el intestino por ingeniería de tejidos ha de traducirse clínicamente. Un biomaterial óptima para el intestino debe tener un árbol vascular innata que puede ser conectado al suministro de la sangre del huésped, una pared tubular niveles con diferentes propiedades para reflejar las capas de la pared intestinal y un eje-vellosidades cripta en el lado luminal para ayudar con repoblación por las células madre epiteliales. Descelularización es una metodología novedosa que produce andamios mediante la eliminación de las células de órganos enteros, mientras que el mantenimiento de su arquitectura original 14. Esto es preferible a las ya existentes andamios, ya que no sólo replicar la estructura del órgano, pero también contienen señales químicas integradas dentro de la matriz extracelular (ECM) que ayuda la proliferación y diferenciación celular. En 2008 una tráquea de cadáver fue descelularizados 14, se siembra con las propias células del paciente, y se trasplanta a reemplazar el bronquio principal izquierdo en un joven <sup&gt; 3. Desde entonces, un número de grupos han informado de la producción de andamios descelularizados para el corazón 15, el hígado 16,17, y de pulmón 18-20 en animales pequeños y grandes. También hemos adaptado la misma metodología para producir un pequeño andamio descelularizado intestinal 21. El objetivo del método descrito en el presente documento es para producir matrices intestinales descelularizados que mantienen las características macroscópicas del tejido original tales como el suministro de sangre, así como la arquitectura microscópica del eje cripta-vellosidad en el lumen intestinal. Creemos que esta metodología en última instancia, podría ser adoptada para otros órganos para mejorar la eficiencia de descelularización.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol solution, 70% in H20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>02877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline tablets</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>79382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Solution (100x)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td>Oral and eye irritant; use protection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a decellularization methodology for the production of a natural acellular intestinal matrix

El éxito de la ingeniería de tejidos implica la combinación de los andamios con las células adecuadas in vitro o in vivo. Los andamios pueden ser sintéticos, de origen natural o derivados de tejidos / órganos. Este último se obtienen usando una técnica llamada descelularización. Descelularización puede implicar una combinación de física, química, y métodos enzimáticos. El objetivo de esta técnica es eliminar todos los restos celulares mientras se mantiene la arquitectura micro-macro y del tejido original. Ingeniería de tejidos intestinales ha utilizado hasta ahora andamios relativamente simples que no replican la compleja arquitectura del órgano nativo. El objetivo de este trabajo es describir una técnica eficiente para descelularización rata intestino delgado. El aislamiento del intestino delgado a fin de garantizar el mantenimiento de una conexión vascular se describe. La combinación de soluciones químicas y enzimáticas para eliminar las células nocst preservar el eje cripta de vellosidades en la cara luminal del andamio se establece también. Finalmente, se discute la evaluación de los andamios fabricados para las características apropiadas.

Al descelularización éxito (Figura 1), el andamio debe tener una apariencia macroscópica similar a la del intestino nativa, pero con paredes translúcidas (Figura 2A). La preservación de la macro-arquitectura también debe ser evidente por la permeabilidad del árbol vascular. Cuando se inyecta un colorante a través de la cánula de SMA, se debe distribuir uniformemente a lo largo del andamio y alcanzar el árbol capilar (Figura 2B). El andamio debe estar libre de material nuclear y citoplasmática, algo que puede ser evaluada usando un kit de cuantificación de ADN y el análisis histológico simple. Tinción con hematoxilina y eosina (H &amp; E) deben demostrar la ausencia de materiales nucleares y citoplasmáticas, preservando las pequeñas capas intestinales (Figura 3A). En particular, el mantenimiento de las vellosidades y criptas en el lado luminal debe ser evidente después de microscopía electrónica de barrido (Figura 4). LaTambién se debe esperar la conservación de componentes de la matriz extracelular tales como colágeno, elastina y glicosaminoglicanos. Por ejemplo, las pantallas de tinción tricrómica de Masson intacta tejido conectivo en el andamio (Figura 3B). <img alt="Figura 1" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/50658/50658fig1.jpg" width="600px" /> Figura 1. . Plan experimental Cronología de procedimiento descelularización; PBS / AA: PBS con NaDeoxy antibiótico-antimicótico,: desoxicolato de sodio, RT: temperatura ambiente, DNasa-I: deoxyribonuclease-I. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50658/50658fig1highres.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver la imagen más grande</a> . <img alt="Figura 2" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/50658/50658fig2.jpg" width="600px" /> Figura 2. Macroscópicamente Andamiosc características. Aspecto macroscópico del intestino delgado de rata tras descelularización éxito (A). La inyección de Rosso Ponceau tinte a través del SMA demuestra una red vascular intacta (B); SMA: arteria mesentérica superior <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50658/50658fig2highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/50658/50658fig3.jpg" width="600px" /> Figura 3. . Histología H &amp; E (A) y MT (B) tinción indican una ausencia de material celular con la preservación de la arquitectura del tejido conectivo, H &amp; E: hematoxilina y eosina, MT: tricrómico de Masson. Barra de escala:. 100 m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50658/50658fig3highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande</a> . </p&gt; <img alt="Figura 4" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/50658/50658fig4.jpg" width="600px" /> Figura 4. . Microscopía electrónica de Microscopía Electrónica de barrido indica la arquitectura de vellosidad-cripta se conserva en el lumen del andamio; Barra de escala:. 100 m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50658/50658fig4highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande</a> .

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A Decellularization Methodology for the Production of a Natural Acellular Intestinal Matrix

El artículo describe una metodología para la producción de una matriz acelular de intestino de rata. La derivación de los andamios intestinal es importante para futuras aplicaciones en la ingeniería de tejidos, biología de células madre y las pruebas de drogas.

Una Metodología Descelularización para la Producción de una matriz Intestinal Natural acelular

Successful tissue engineering involves the  combination of scaffolds with appropriate cells in vitro or in vivo.  Scaffolds may be synthetic, ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

29.1K vistas.  University College London.  El artículo describe una metodología para la producción de una matriz acelular de intestino de rata. La derivación de los andamios intestinal es importante para futuras aplicaciones en la ingeniería de tejidos, biología de células madre y las pruebas de drogas. 

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Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

Los hidrogeles sintonizable de la matriz extracelular pulmonar por la 3D de Cultivos Celulares

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Investigación

Bioingeniería

Decellularization and Recellularization Methodology for Human Saphenous Veins

Vascular conduits used during most vascular surgeries are allogeneic or synthetic grafts that often lead to complications caused by immunosuppression and poor patency. Tissue engineering offers a novel solution to generate personalized grafts with a natural extracellular matrix containing the recipient&#39;s cells using the method of decellularization and recellularization. We show a detailed method for performing decellularization of the human saphenous vein and recellularization by perfusion of peripheral blood. The vein was decellularized by perfusing 1% Triton X-100, 1% tri-n-butyl-phosphate (TnBP) and 2,000 Kunitz units of deoxyribonuclease (DNase). Triton X-100 and TnBP were perfused at 35 mL/min for 4 h while DNase was perfused at 10 mL/min at 37 &#176;C for 4 h. The vein was washed in ultrapure water and PBS and then sterilized in 0.1% peracetic acid. It was washed again in PBS and preconditioned in endothelial medium. The vein was connected to a bioreactor and perfused with endothelial medium containing 50 IU/mL heparin for 1 h. Recellularization was performed by filling the bioreactor with fresh blood, diluted 1:1 in Steen solution, and adding endocrine gland-derived vascular endothelial growth factors (80 ng/mL), basic fibroblast growth factors (4 &#181;L/mL), and acetyl salicylic acid (5 &#181;g/mL). The bioreactor was then moved into an incubator and perfused for 48 h at 2 mL/min while maintaining glucose between 3 - 9 mmol/L. Later, the vein was washed with PBS, filled with endothelial medium and perfused for 96 h in the incubator. Treatment with Triton X-100, TnBP and DNase decellularized the saphenous vein in 5 cycles. The decellularized vein looked white in contrast to normal and recellularized veins (light red). The hematoxylin &#38; eosin (H&#38;E) staining showed the presence of nuclei only in normal but not in decellularized veins. In the recellularized vein, H&#38;E-staining showed the presence of cells on the luminal surface of the vein.

Here, we describe a protocol for the saphenous vein decellularization using detergents and recellularization by perfusion of the peripheral blood and the endothelial medium.

Descelularización y recelularización metodología de venas safenas humanas

Vascular conduits used during most vascular surgeries are allogeneic or synthetic grafts that often lead to complications caused by immunosuppression and ...

Decellularization of Whole Human Heart Inside a Pressurized Pouch in an Inverted Orientation

The ultimate solution for patients with end-stage heart failure is organ transplant. But donor hearts are limited, immunosuppression is required, and ultimately rejection can occur. Creating a functional, autologous bio-artificial heart could solve these challenges. Biofabrication of a heart comprised of scaffold and cells is one option. A natural scaffold with tissue-specific composition as well as micro- and macro-architecture can be obtained by decellularizing hearts from humans or large animals such as pigs. Decellularization involves washing out cellular debris while preserving 3D extracellular matrix and vasculature and allowing &#34;cellularization&#34; at a later timepoint. Capitalizing on our novel finding that perfusion decellularization of complex organs is possible, we developed a more &#34;physiological&#34; method to decellularize non-transplantable human hearts by placing them inside a pressurized pouch, in an inverted orientation, under controlled pressure. The purpose of using a pressurized pouch is to create pressure gradients across the aortic valve to keep it closed and improve myocardial perfusion. Simultaneous assessment of flow dynamics and cellular debris removal during decellularization allowed us to monitor both fluid inflow and debris outflow, thereby generating a scaffold that can be used either for simple cardiac repair (e.g. as a patch or valve scaffold) or as a whole-organ scaffold.

This method enables decellularization of a complex solid organ using a simple protocol based on osmotic shock and perfusion of ionic detergent with minimal organ matrix disruption. It comprises a novel decellularization technique for human hearts inside a pressurized pouch with real-time monitoring of flow dynamics and cellular debris outflow.

Descelularización de todo humano corazón dentro de una bolsa presurizada en una orientación invertida

The ultimate solution for patients with end-stage heart failure is organ transplant. But donor hearts are limited, immunosuppression is required, and ...

Isolation and Decellularization of a Whole Porcine Pancreas

Tissue engineering of the whole pancreas can improve current treatments for diabetes mellitus. The ultimate goal is to tissue engineer pancreas from an allogeneic or xenogeneic source with human cells. A demonstration of methods for the efficient dissection, decellularization, and recellularization of porcine pancreas might benefit the field. Akin to human pancreases, porcine pancreases have a special anatomical arrangement with three lobes (splenic, duodenal, and connection) rounded by the duodenum and small intestine. The duodenal lobe of the pancreas connects to the duodenum by several small blood vessels. Tissue engineering of the pancreas is complicated because of its exocrine and endocrine nature. In this paper, we show a detailed protocol to dissect the whole porcine pancreas and decellularize it with detergents while saving its structure and some extracellular matrix components. To achieve complete perfusion, the aorta is chosen as inlet and the portal vein as outlet. The other blood vessels (hepatic artery, splenic vein, splenic artery,&#160;mesenteric artery and vein tree) and bile duct are ligated. To prevent the formation of thrombus, the pig is heparinized and, immediately after dissection, the organ is flushed with cold heparin. To inhibit the action of exocrine enzymes, the pancreas decellularization is set at 4 &#176;C. The decellularization is performed by perfusion of Triton X-100, sodium deoxycholate, and deoxyribonuclease, with an intermittent and final extensive washing. With a successful decellularization, the pancreas appears white, and a histological evaluation with hematoxylin and eosin shows an absence of nuclei with a preserved extracellular matrix structure. Thus, the proposed method can be used to successfully dissect and decellularize whole porcine pancreas.

Tissue engineering of the whole pancreas is a challenge because of its exocrine and endocrine functions. We show a method for the dissection of an intact porcine pancreas and the process of successful decellularization by perfusion of detergents Triton X-100, sodium deoxycholate, and deoxyribonuclease.

Aislamiento y la descelularización de un páncreas todo porcino

Tissue engineering of the whole pancreas can improve current treatments for diabetes mellitus. The ultimate goal is to tissue engineer pancreas from an ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust mechanical support for in vitro cell culture but lack the necessary protein and ligand composition to elicit physiological behavior from cells. This manuscript describes a fabrication method for a kidney cortex ECM-derived hydrogel with proper mechanical robustness and supportive biochemical composition. The hydrogel is fabricated by mechanically homogenizing and solubilizing decellularized human kidney cortex ECM. The matrix preserves native kidney cortex ECM protein ratios while also enabling gelation to physiological mechanical stiffnesses. The hydrogel serves as a substrate upon which kidney cortex-derived cells can be maintained under physiological conditions. Furthermore, the hydrogel composition can be manipulated to model a diseased environment which enables the future study of kidney diseases.

Here we present a protocol to fabricate a kidney cortex extracellular matrix-derived hydrogel to retain the native kidney extracellular matrix (ECM) structural and biochemical composition. The fabrication process and its applications are described. Finally, a perspective on using this hydrogel to support kidney-specific cellular and tissue regeneration and bioengineering is discussed.

Fabricación de un hidrogel de derivados de matriz extracelular renal corteza

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of cellular function. The ECM plays a particularly important role in adipose tissue function in obesity, and alterations in adipose tissue ECM deposition and composition are associated with metabolic disease in mice and humans. Tractable in vitro models that permit dissection of the roles of the ECM and cells in contributing to global tissue phenotype are sparse. We describe a novel 3D in vitro model of human ECM-adipocyte culture that permits study of the specific roles of the ECM and adipocytes in regulating adipose tissue metabolic phenotype. Human adipose tissue is decellularized to isolate ECM, which is subsequently repopulated with preadipocytes that are then differentiated within the ECM into mature adipocytes. This method creates ECM-adipocyte constructs that are metabolically active and retain characteristics of the tissues and patients from which they are derived. We have used this system to demonstrate disease-specific ECM-adipocyte crosstalk in human adipose tissue. This culture model provides a tool for dissecting the roles of the ECM and adipocytes in contributing to global adipose tissue metabolic phenotype and permits study of the role of the ECM in regulating adipose tissue homeostasis.

We describe a 3D human extracellular matrix-adipocyte in vitro culture system that permits dissection of the roles of the matrix and adipocytes in contributing to adipose tissue metabolic phenotype.

Un modelo de cultivo de matriz-adipocitos extracelulares 3D humano para el estudio de la conversación cruzada metabólica Matrix-Cell

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes all liposomes of the ensemble to be identical. However, new experimental platforms able to observe liposomes at the single-particle level have made it possible to perform highly sophisticated and quantitative studies on protein-membrane interactions or drug carrier properties on individual liposomes, thus avoiding errors from ensemble averaging. Here we present a protocol for preparing, detecting, and analyzing single liposomes using a fluorescence-based microscopy assay, facilitating such single-particle measurements. The setup allows for imaging individual liposomes in a massive parallel manner and is employed to reveal intra-sample size and compositional inhomogeneities. Additionally, the protocol describes the advantages of studying liposomes at the single liposome level, the limitations of the assay, and the important features to be considered when modifying it to study other research questions.

This protocol describes the fabrication of liposomes and how these can be immobilized on a surface and imaged individually in a massive parallel manner using fluorescence microscopy. This allows for the quantification of the size and compositional inhomogeneity between single liposomes of the population.

Un ensayo de liposomio único basado en microscopía de fluorescencia cuantitativa para detectar la inhomogeneidad compositiva entre liposomas individuales

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

Production of Membrane-Filtered Phase-Shift Decafluorobutane Nanodroplets from Preformed Microbubbles

There are many methods that can be used for the production of vaporizable phase-shift droplets for imaging and therapy. Each method utilizes different techniques and varies in price, materials, and purpose. Many of these fabrication methods result in polydisperse populations with non-uniform activation thresholds. Additionally, controlling the droplet sizes typically requires stable perfluorocarbon liquids with high activation thresholds that are not practical in vivo. Producing uniform droplet sizes using low-boiling point gases would be beneficial for in vivo imaging and therapy experiments. This article describes a simple and economical method for the formation of size-filtered lipid-stabilized phase-shift nanodroplets with low-boiling point decafluorobutane (DFB). A common method of generating lipid microbubbles is described, in addition to a novel method of condensing them with high-pressure extrusion in a single step. This method is designed to save time, maximize efficiency, and generate larger volumes of microbubble and nanodroplet solutions for a wide variety of applications using common laboratory equipment found in many biological laboratories.

This protocol describes a method of generating large volumes of lipid encapsulated decafluorobutane microbubbles using probe-tip sonication and subsequently condensing them into phase-shift nanodroplets using high-pressure extrusion and mechanical filtration.

Producción de nanogotas de decafluorobutano de cambio de fase filtradas por membrana a partir de microburbujas preformadas

There are many methods that can be used for the production of vaporizable phase-shift droplets for imaging and therapy. Each method utilizes different ...

Light-Controlled Fermentations for Microbial Chemical and Protein Production

Microbial cell factories offer a sustainable alternative for producing chemicals and recombinant proteins from renewable feedstocks. However, overburdening a microorganism with genetic modifications can reduce host fitness and productivity. This problem can be overcome by using dynamic control: inducible expression of enzymes and pathways, typically using chemical- or nutrient-based additives, to balance cellular growth and production. Optogenetics offers a non-invasive, highly tunable, and reversible method of dynamically regulating gene expression. Here, we describe how to set up light-controlled fermentations of engineered Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae for the production of chemicals or recombinant proteins. We discuss how to apply light at selected times and dosages to decouple microbial growth and production for improved fermentation control and productivity, as well as the key optimization considerations for best results. Additionally, we describe how to implement light controls for lab-scale bioreactor experiments. These protocols facilitate the adoption of optogenetic controls in engineered microorganisms for improved fermentation performance.

Optogenetic control of microbial metabolism offers flexible dynamic control over fermentation processes. The protocol here shows how to set up blue light-regulated fermentations for chemical and protein production at different volumetric scales.

Fermentaciones controladas por la luz para la producción química microbiana y de proteínas

Microbial cell factories offer a sustainable alternative for producing chemicals and recombinant proteins from renewable feedstocks. However, ...

Configuración de un dispositivo microfluídico para la producción de tapones combinatorios

Bilayer Microfluidic Device for Combinatorial Plug Production

Droplet microfluidics is a versatile tool that allows the execution of a large number of reactions in chemically distinct nanoliter compartments. Such systems have been used to encapsulate a variety of biochemical reactions - from incubation of single cells to implementation of PCR reactions, from genomics to chemical synthesis. Coupling the microfluidic channels with regulatory valves allows control over their opening and closing, thereby enabling the rapid production of large-scale combinatorial libraries consisting of a population of droplets with unique compositions. In this paper, protocols for the fabrication and operation of a pressure-driven, PDMS-based bilayer microfluidic device that can be utilized to generate combinatorial libraries of water-in-oil emulsions called plugs are presented. By incorporating software programs and microfluidic hardware, the flow of desired fluids in the device can be controlled and manipulated to generate combinatorial plug libraries and to control the composition and quantity of constituent plug populations. These protocols will expedite the process of generating combinatorial screens, particularly to study drug response in cells from cancer patient biopsies.

Autor destacado: Integración de enfoques computacionales y experimentales en oncología de precisión

The fabrication of a polydimethylsiloxane (PDMS)-based bilayer device for the production of combinatorial libraries in water-in-oil emulsions (plugs) is presented here. The necessary hardware and software required to automate plug production are detailed in the protocol, and the production of a quantitative library of fluorescent plugs is also demonstrated.

Dispositivo microfluídico bicapa para la producción de tapones combinatorios

Droplet microfluidics is a versatile tool that allows the execution of a large number of reactions in chemically distinct nanoliter compartments. Such ...