Así que el objetivo del método en nuestro manuscrito es proporcionar un análisis comparativo de las vías de señalización en células mieloides utilizando sistemas humanos y de ratón. Ayuda a definir qué vía de señalización está implicada aguas abajo de los receptores de reconocimiento de patrones seleccionados. Así que este método es fácil de implementar.
Se basa en preparaciones de células primarias y compuestos de referencia validados, que es esencial para el esclareciómiento de los mecanismos de señalización. Demostrar el procedimiento serán Ratiba Touil y Adeline Unterreiner, respectivamente científica y asociada de investigación en nuestro grupo. En una capucha de flujo laminar estableció un par de tijeras estériles, un vaso de precipitados de un litro y una bolsa de plástico.
Coloque la capa buffy previamente obtenida en el vaso de precipitados y use las tijeras para abrirla cuidadosamente. Usando una pipeta de 25 mm añadir 100 ml de PBS complementado con 2 milimolar de EDTA. Mezclar en pipeteando lentamente hacia arriba y hacia abajo.
Y luego transferir 25 ml de la capa de buffy diluida en seis tubos de centrífuga cónica de 50 ml que han sido precargados con 15 ml de gradiente de densidad basado en polisacárido. Centrifugar los tubos durante 20 minutos a 800 g con una aceleración moderada sin la rotura para permitir la separación de las células en función de sus densidades. Después de la centrifugación se verán tres capas, un gránulo que contiene glóbulos rojos y granulocitos, una capa superior hecha de plasma, y un anillo blanco que contiene células mononucleares de sangre periférica.
Utilice una pipeta de 10 ml para cosechar los anillos PBMC y transferirlos a un nuevo tubo de 50 ml. Recarga con PBS y EDTA. Realice tres lavados sucesivos con disminución del tiempo de centrifugación y la velocidad como se describe en el protocolo de texto.
Después del lavado final, resuspender el pellet en 25 ml de tampón de lyis helada para la lyse los glóbulos rojos por presión osmótica. Incubar la solución a temperatura ambiente hasta que quede clara. A continuación, añadir 25 ml de tampón de separación para detener la reacción.
Centrifugar a 150 g durante ocho minutos para lavar la solución. Vierta el sobrenadante y resusppend el pellet con tampón de separación. Después de contar las células, diluirlas en medio de cultivo hasta 12.500 células por pozo.
Distribuir 30 ml de esta suspensión celular en cada pozo de una placa de 384 pozos. A continuación, añada 15 microlitros de cuatro soluciones compuestas concentradas a cada pozo y preincubate la placa a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono durante una hora. Si lo desea, añada LPS a la concentración final de 1 ng por ml o Zymosan agotado a una concentración final de 100 mcg por ml.
Luego incubar la placa durante la noche a 37 grados celsius con 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente tomar 10 microlitros del sobrenadante para medir los niveles alfa de TNF secretados. Para iniciar la dilución en serie, diluya la solución de stock MLT-827 con una concentración media para alcanzar una concentración de 8 micromolares de una sola vez.
Realice una dilución en serie de seis pasos 1:5 utilizando el medio con 0.08%DMSO. Para prepararse para pruebas de dosis únicas, diluya las soluciones de stock MLT-827, AFN700 y compuesto 11 con medio para alcanzar una concentración de 4 micromolares de una sola vez. En primer lugar, añadir 2 ml de agua estéril libre de endotoxinas a 10 mg de Zymosan agotado.
Vortex esta solución de stock para homogeneizarlo. Aliquot la solución y luego almacenar las alícuotas a 20 grados Celsius. En este estudio, los PBMC humanos y las células del bazo de ratón se estimulan con Zymosan agotado, un agonista Dectina-1, o lipopolisacárido, un agonista TL4.
La liberación alfa NTNF en el sobrenadante se mide después de 20 horas. En los ensayos humano y ratón, el compuesto MLT-827 bloquea selectivamente la producción alfa TNF impulsada por la vía Dectin-1, pero no por la vía TLR4. En monocitos estimulados con LPS, la producción de TNF alfa es casi completamente abrogada por AFN700 pero no es sensible a Cpd11, que es consistente con la dependencia de la vía TLR4 de la actividad NF-kappa B y su independencia en la actividad siC.
En contraste, la producción alfa TNF impulsada por Dectin-1 y MODC muestra sensibilidad a MLT-827, AFN700 y Cpd11. Esto proporciona más evidencia para la participación de una cascada de señalización SIC CBM en la vía Dectin-1. La producción de IL-1 beta, IL-6 e IL-23 también es sensible a los tres inhibidores, lo que indica mecanismos reguladores similares al alfa TNF.
Sin embargo, el efecto limitado observado en la producción de IL-8 sugiere que esta citoquina tiene un mecanismo regulatorio distinto. Aumentar las concentraciones de trehalosa-dibehenate por encima de 50 mcg por ml conduce a la producción de TNF alfa, IL-6 e IL-1 beta, que se basaron en la actividad de paracaspacse MALT1 de acuerdo con el efecto de bloqueo de MLT-827. Se observaron resultados similares al desafiar a los MODC con concentraciones crecientes de Zymosan agotado para estimular la Dectina-1.
Este método hizo posible demostrar que la paracaspacse MALT1 regula selectivamente la señalización del receptor similar a la lectina de tipo C. Es esencial utilizar compuestos de referencia bien caracterizados. Preste atención al procedimiento para la dilución de soluciones de stock.
Esto es crítico para compuestos con solubilidad limitada.
