因此，本文中的方法的目的是利用人类和小鼠系统对骨髓细胞中信号通路进行对比分析。它有助于定义所选模式识别受体的下游涉及哪个信号通路。因此，此方法易于实现。
它依赖于原细胞制剂和经过验证的参考化合物，这对信号机制的阐明至关重要。演示该程序将是拉蒂巴·图伊勒和阿德琳·乌勒纳，分别是我们小组的科学家和研究员。在层流罩中，有一把无菌剪刀、一升烧杯和一个塑料袋。
将先前获得的布衣放入烧杯中，然后用剪刀小心地打开。使用 25 毫米移液器添加 100 ml 的 PBS，并辅以 2 毫摩尔的 EDTA。通过缓慢向上和向下移液混合。
然后将25毫升稀释的布衣转移到6个50毫升锥形离心管中，每个管都预填充了15毫升聚糖基密度梯度。在800克下将管子离心20分钟，加速度适中，无需中断，即可根据细胞密度分离细胞。离心后，将可见三层，含有红血球和粒细胞的颗粒，由血浆制作的上层，以及含有外周血单核细胞的白环。
使用 10 ml 移液器收获 PBMC 环，然后将其转移到新的 50 ml 管中。用 PBS 和 EDTA 进行顶点。执行三次连续洗涤，如文本协议中所述，离心时间和速度降低。
最后洗涤后，将颗粒重新在25ml的冰冷溶解缓冲液中，通过渗透压力对红血球进行解压。在室温下孵育溶液，直到溶液变得清晰。然后加入25毫升分离缓冲液，停止反应。
在 150 g 下离心 8 分钟，清洗溶液。从上流液中倒出，用分离缓冲液重新浇注颗粒。计算细胞后，在培养基中稀释它们，每井12，500个细胞。
将 30 ml 的电池悬浮液分配到 384 井板的每个井中。接下来，在每井中加入15个4倍的浓缩化合物溶液，并在37摄氏度下用5%的二氧化碳预孵化板一小时。如果需要，将LPS添加到每毫升1纳克的最终浓度中，或将耗尽的Zymosan加入到每毫升100微克的最终浓度中。
然后在37摄氏度下孵育板，用5%的二氧化碳孵育。第二天，服用10微升的上一代来测量分泌的TNFα水平。要开始连续稀释，请用介质稀释 MLT-827 库存溶液，一次达到 8 微摩尔的浓度。
使用 0.08% DMSO 的介质执行六步 1：5 串行稀释。为准备单剂量测试，稀释MLT-827、AFN700和化合物11库存溶液，一次达到4微摩尔的浓度。首先，在10毫克的贫乏的Zymosan中加入2毫升无菌无内毒素水。
漩涡这种库存溶液，以均质化它。将溶液等一，然后将等分储存在 20 摄氏度。在这项研究中，人类PBMC和小鼠脾脏细胞被刺激与耗尽的Zymosan，一个德金-1激动剂，或脂质多糖，TL4激动剂。
上经剂中的NTNFα释放在20小时后测量。在人类和小鼠的测定中，MLT-827化合物选择性地阻止由 Dectin-1 通路驱动的 TNF alpha 生产，而不是由 TLR4 通路驱动的 TNF alpha 生产。在使用LPS刺激的单核细胞中，TNF alpha的生产几乎完全被AFN700所废除，但它对Cpd11不敏感，这与TLR4通路对NF-kappa B活性的依赖性及其对SIC活性的依赖性是一致的。
相比之下，由 Dectin-1 和 MODC 驱动的 TNF alpha 生产显示对 MLT-827、AFN700 和 Cpd11 的灵敏度。这为在 Dectin-1 通路中参与 SIC CBM 信令级联提供了进一步的证据。IL-1β、IL-6和IL-23的生产对三种抑制剂也敏感，表明其调控机制与TNF alpha相似。
然而，对IL-8生产的影响有限，表明这种细胞因子具有独特的调控机制。将Trehalose-二白酸酶浓度提高至每毫升50微克以上，可产生TNF alpha、IL-6和IL-1β，根据MLT-827的阻断效应，这些β依赖于ALT1抛物酶活性。类似的结果，当挑战MODC与增加浓度耗尽的Zymosan刺激德金-1。
这种方法使得能够证明抛物线马尔特1选择性地调节C型卵磷脂样受体信号。必须使用具有良好特征的参考化合物。注意库存溶液稀释过程。
这对溶解度有限的化合物至关重要。
