Bu nedenle makalemizdeki yöntemin amacı, insan ve fare sistemlerini kullanarak miyeloid hücrelerdeki sinyal yollarının karşılaştırmalı analizini sağlamaktır. Seçilen örüntü tanıma reseptörlerinin aşağısında hangi sinyal yolunun yer aldığını tanımlamaya yardımcı olur. Yani bu yöntemin uygulanması basittir.
Bu birincil hücre preparatları ve doğrulanmış referans bileşikleri dayanır, hangi sinyal mekanizmalarının açıklanması için gerekli olan. Prosedürü gösteren Ratiba Touil ve Adeline Unterreiner, sırasıyla bilim adamı ve araştırma ortağı grubumuzda olacaktır. Bir laminar akış başlık makas steril bir çift yola, bir litre beher, ve plastik bir torba.
Beher içine daha önce elde edilen buffy ceket yerleştirin ve dikkatle açmak için makas kullanın. 25 mm'lik pipet kullanılarak 2 milimolar EDTA ile takviye edilmiş 100 ml PBS ekleyin. Yavaşça yukarı ve aşağı boru ile karıştırın.
Ve sonra her biri 15 ml polisakkarit bazlı yoğunluk gradyanı ile önceden doldurulmuş altı 50 ml konik santrifüj tüpler içine seyreltilmiş buffy ceket 25 ml aktarın. Tüpleri 800 g'da 20 dakika boyunca, hücrelere yoğunluklarına göre ayrılmasına izin vermek için mola vermeden orta hızda santrifüj edin. Santrifüjden sonra üç tabaka görünür olacak, kırmızı kan hücreleri ve granülositler içeren bir pelet, plazmadan yapılmış bir üst tabaka, ve periferik kan mononükleer hücreleri içeren beyaz bir halka.
PBMC halkaları hasat ve yeni bir 50 ml tüp içine aktarmak için 10 ml pipet kullanın. PBS ve EDTA ile top up. Metin protokolünde belirtildiği gibi azalan santrifüj süresi ve hızı yla art arda üç yıkıntı gerçekleştirin.
Son yıkamadan sonra, ozmotik basınç ile kırmızı kan hücrelerini lyse buz soğuk lysis tampon 25 ml pelet resuspend. Çözeltiyi oda sıcaklığında netleşene kadar kuluçkaya yatırın. Daha sonra reaksiyonu durdurmak için 25 ml ayırma tamponu ekleyin.
Çözeltiyi yıkamak için sekiz dakika boyunca 150 g'de santrifüj. Supernatant dökün ve ayırma tampon uğrama pelet resuspend. Hücreleri sayarak, kültür orta aşağı 12, kuyu başına 500 hücreleri seyreltmek.
384 kuyu plakaher kuyuiçine bu hücre süspansiyon 30 ml dağıtın. Sonraki her kuyuya dört kat konsantre bileşik çözelti15 mikrolitre ekleyin ve bir saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derece plaka preincubate. İstenirse, ml başına 1 ng nihai konsantrasyona LPS ekleyin veya ml başına 100 mcg son konsantrasyona zymosan tükenmiş.
Sonra plakayı bir gecede %5 karbondioksitle 37 derecede kuluçkaya yatırın. Ertesi gün salgılanan TNF alfa seviyelerini ölçmek için supernatant 10 mikrolitre almak. Seri seyreltmeye başlamak için MLT-827 stok çözeltisini orta ile seyreltin ve tek bir vuruşta 8 mikromolar konsantrasyonuna ulaşın.
%0,08 DMSO ile orta kullanarak altı adımlı 1:5 seri seyreltme gerçekleştirin. Tek doz testleri için hazırlamak için, MLT-827, AFN700 seyreltmek ve orta ile bileşik 11 stok çözümleri bir gitmek 4 mikromolar bir konsantrasyonulaşmak için. İlk olarak, 10 mg tükenmiş Zymosan'a 2 ml steril endotoksinsiz su ekleyin.
Vortex bu stok çözeltisi homojenize etmek. Aliquot çözeltisi ve sonra 20 santigrat derece aliquots saklayın. Bu çalışmada insan PBMCs ve fare dalak hücreleri ya tükenmiş Zymosan, bir Dectin-1 agonist veya lipopolisakkarit, bir TL4 agonist ile uyarılır.
Supernatant NTNF alfa salınımı 20 saat sonra ölçülür. Hem insan hem de fare tahlillerinde MLT-827 bileşiği, DECTin-1 yolu tarafından yönlendirilen TNF alfa üretimini seçici olarak engeller, ancak TLR4 yolu tarafından değil. LPS ile uyarılan monositlerde, TNF alfa üretimi AFN700 ile neredeyse tamamen ortadan kalmaktadır ancak TLR4 yolunun NF-kappa B aktivitesine olan bağımlılığı ve SIC aktivitesine olan bağımlılığı ile tutarlı olan Cpd11'e karşı hassas değildir.
Buna karşılık Dectin-1 ve MODC'lar tarafından yönlendirilen TNF alfa üretimi MLT-827, AFN700 ve Cpd1'e duyarlılık gösterir. Bu Dectin-1 yolunda bir SIC CBM sinyal kaskad katılımı için daha fazla kanıt sağlar. IL-1 beta, IL-6 ve IL-23 üretimi de tnf alfabenzer düzenleyici mekanizmaları gösteren, üç inhibitörleri duyarlıdır.
Ancak, IL-8 üretimi üzerinde görülen sınırlı etkisi bu sitokin ayrı bir düzenleyici mekanizma olduğunu göstermektedir. Ml başına 50 mcg'nin üzerinde trehalose-dibehenate konsantrasyonlarının yükseltilmesi, MLT-827'nin bloke edici etkisine göre MALT1 parakaspas aktivitesine dayanan TNF alfa, IL-6 ve IL-1 beta üretimine yol açar. Benzer sonuçlar Dectin-1 uyarmak için tükenmiş Zymosan artan konsantrasyonları ile MODCs zorlu görüldü.
Bu yöntem, parakasaz MALT1'in C-tipi lektin benzeri reseptör sinyalini seçici olarak düzenlediğini göstermeyi mümkün kAbdirdi. Bu iyi karakterize referans bileşikleri kullanmak esastır. Stok çözeltilerinin seyreltilmesi prosedürüne dikkat edin.
Bu sınırlı çözünürlüğe sahip bileşik için çok önemlidir.
