Ainsi, le but de la méthode dans notre manuscrit est de fournir une analyse comparative des voies de signalisation dans les cellules myéloïdes à l’aide de systèmes humains et muraux. Il aide à définir quelle voie de signalisation est impliquée en aval de certains récepteurs de reconnaissance de motifs. Cette méthode est donc simple à mettre en œuvre.
Il s’appuie sur les préparations cellulaires primaires et les composés de référence validés, ce qui est essentiel pour l’élucidation des mécanismes de signalisation. Ratiba Touil et Adeline Unterreiner, respectivement scientifique et associée de recherche dans notre groupe, démontreront la procédure. Dans une hotte d’écoulement laminaire mis en place une paire stérile de ciseaux, un bécher d’un litre, et un sac en plastique.
Placez le pelage bouffi précédemment obtenu dans le bécher et utilisez les ciseaux pour l’ouvrir soigneusement. À l’aide d’une pipette de 25 mm, ajouter 100 ml de PBS complétés par 2 millimolaires d’EDTA. Mélanger en pipetting lentement de haut en bas.
Et puis transférer 25 ml de la couche buffy diluée en six tubes de centrifugeuse conique de 50 ml qui ont chacun été précalillés avec 15 ml de gradient de densité à base de polysaccharide. Centrifugeuse les tubes pendant 20 minutes à 800 g avec accélération modérée sans rupture pour permettre la séparation des cellules en fonction de leur densité. Après centrifugation, trois couches seront visibles, une pastille contenant des globules rouges et des granulocytes, une couche supérieure en plasma et un anneau blanc contenant des cellules mononucléaires périphériques du sang.
Utilisez une pipette de 10 ml pour récolter les anneaux PBMC et les transférer dans un nouveau tube de 50 ml. Rechargez-le avec PBS et EDTA. Effectuez trois lavages successifs avec une diminution du temps et de la vitesse de centrifugation, comme le décrit le protocole texte.
Après le lavage final, resuspendez la pastille dans 25 ml de tampon de lyse glacée pour lyser les globules rouges par pression osmotique. Incuber la solution à température ambiante jusqu’à ce qu’elle devienne claire. Ajouter ensuite 25 ml de tampon de séparation pour arrêter la réaction.
Centrifugeuse à 150 g pendant huit minutes pour laver la solution. Versez le supernatant et resuspendez la pastille avec le tampon de séparation. Après avoir compté les cellules, diluer dans le milieu de la culture jusqu’à 12 500 cellules par puits.
Répartir 30 ml de cette suspension cellulaire dans chaque puits d’une plaque de puits de 384. Ajoutez ensuite 15 microlitres de quatre solutions composées concentrées à chaque puits et préincubez la plaque à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant une heure. Si désiré, ajouter le LPS à la concentration finale de 1 ng par ml ou le Zymosan épuisé à une concentration finale de 100 mcg par ml.
Puis incuber la plaque pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Le lendemain, prenez 10 microlitres du supernatant pour mesurer les niveaux alpha TNF sécrétés. Pour commencer la dilution en série, diluer la solution de stock MLT-827 avec moyen pour atteindre une concentration de 8 micromolaires en une seule fois.
Effectuez une dilution en série en six étapes 1:5 à l’aide d’un support avec 0,08% DMSO. Pour se préparer aux tests à dose unique, diluer le MLT-827, l’APN700 et composé 11 solutions de stock avec moyen pour atteindre une concentration de 4 micromolaires en une seule fois. Tout d’abord, ajouter 2 ml d’eau stérile sans endotoxine à 10 mg de zymosan appauvri.
Vortex cette solution de stock pour l’homogénéiser. Aliquot la solution, puis stocker les aliquots à 20 degrés Celsius. Dans cette étude, les PBMCs humains et les cellules de la rate de souris sont stimulés soit avec zymosan épuisé, agoniste de déctine-1, soit lipopolysaccharide, agoniste TL4.
La libération alpha NTNF dans le surnatant est mesurée après 20 heures. Dans les analyses humaines et souris, le composé MLT-827 bloque sélectivement la production alpha du TNF entraînée par la voie Dectin-1, mais pas par la voie TLR4. Chez les monocytes stimulés par le LPS, la production d’alpha TNF est presque entièrement abrogée par l’APN700, mais elle n’est pas sensible au Cpd11, ce qui est compatible avec la dépendance de la voie TLR4 à l’activité du NF-kappa B et son indépendance sur l’activité du SIC.
En revanche, la production alpha de TNF entraînée par Dectin-1 et les MODCs montre une sensibilité au MLT-827, à l’AFN700 et au Cpd11. Cela fournit d’autres preuves de la participation d’une cascade de signalisation CBM de la SIC dans la voie Dectin-1. La production d’IL-1 bêta, IL-6 et IL-23 est également sensible aux trois inhibiteurs, indiquant des mécanismes réglementaires similaires à TNF alpha.
Cependant, l’effet limité observé sur la production d’IL-8 suggère que cette cytokine a un mécanisme réglementaire distinct. L’augmentation des concentrations de Tréhalose-dibehenate au-dessus de 50 mcg par ml conduit à la production de bêta TNF alpha, IL-6 et IL-1, qui s’est appuyée sur l’activité malt1 paracaspase selon l’effet de blocage du MLT-827. Des résultats similaires ont été observés lors de la remise en question des MODCs avec des concentrations croissantes de Zymosan épuisé pour stimuler Dectin-1.
Cette méthode a permis de montrer que la paracaspase MALT1 régule sélectivement la signalisation des récepteurs de type C. Il est essentiel d’utiliser des composés de référence bien caractérisés. Faites attention à la procédure de dilution des solutions de stock.
Ceci est essentiel pour le composé avec une solubilité limitée.
