لذا فإن الهدف من الطريقة في مخطوطتنا هو توفير تحليل مقارن لمسارات الإشارات في الخلايا النخاعية باستخدام أنظمة الإنسان والفأر. وهو يساعد على تحديد مسار الإشارة الذي ينطوي على المصب من مستقبلات التعرف على نمط مختارة. لذلك هذا الأسلوب هو بسيط لتنفيذ.
وهو يعتمد على الاستعدادات الأولية للخلية والمركبات المرجعية التي تم التحقق منها، وهو أمر ضروري لتوضيح آليات الإشارات. وسوف يكون إثبات الإجراء راتيبا Touil و Adeline Unterreiner، على التوالي عالم والبحوث الزميلة في مجموعتنا. في غطاء تدفق لارينار تعيين زوج معقمة من مقص، واحد لتر منقار، وكيس من البلاستيك.
ضع معطف بافي التي تم الحصول عليها سابقا في beaker واستخدام مقص لفتح بعناية. باستخدام ماصة 25 مم إضافة 100 مل من برنامج تلفزيوني تكملها 2 ملليمتر من EDTA. مزيج عن طريق الأنابيب ببطء صعودا وهبوطا.
ثم نقل 25 مل من معطف بافي المخفف إلى ستة 50 مل أنابيب أجهزة الطرد المركزي المخروطية التي تم ملء كل مسبقا مع 15 مل من التدرج كثافة السكرييد القائمة. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب لمدة 20 دقيقة في 800 غرام مع تسارع معتدل دون كسر للسماح لفصل الخلايا على أساس كثافاتها. بعد الطرد المركزي ثلاث طبقات ستكون مرئية، بيليه تحتوي على خلايا الدم الحمراء والميقبتات، وطبقة عليا مصنوعة من البلازما، وحلقة بيضاء تحتوي على خلايا أحادية النوى الدم المحيطية.
استخدام ماصة 10 مل لحصاد حلقات PBMC ونقلها إلى أنبوب 50 مل جديدة. أعلى مع برنامج تلفزيوني وEDTA. تنفيذ ثلاثة يغسل متتالية مع تقليل وقت الطرد المركزي والسرعة كما هو موضح في بروتوكول النص.
بعد الغسيل النهائي ، resuspend بيليه في 25 مل من الجليد الباردة تحلل العازلة لتحلل خلايا الدم الحمراء عن طريق الضغط التناضح. احتضان الحل في درجة حرارة الغرفة حتى يصبح واضحا. ثم إضافة 25 مل من العازلة الفصل لوقف رد الفعل.
جهاز طرد مركزي في 150 غرام لمدة ثماني دقائق لغسل الحل. صب قبالة مفطل وإعادة فرض بيليه مع العازلة الفصل. بعد عد الخلايا، وتمييع لهم في المتوسط الثقافة وصولا الى 12500 الخلايا في البئر.
توزيع 30 مل من هذا التعليق الخلية في كل بئر من 384 لوحة جيدا. التالي إضافة 15 ميكرولتردات من أربع مرات مجمعة الحلول المركزة لكل بئر وpreincubate لوحة في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة واحدة. إذا رغبت في ذلك، إضافة إما LPS إلى التركيز النهائي من 1 نانوغرام لكل مل أو Zymosan المنضب إلى تركيز نهائي من 100 ميكروغرام لكل مل.
ثم احتضان لوحة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي تأخذ 10 ميكرولترات من عظمى لقياس المستويات ألفا TNF يفرز. لبدء التخفيف التسلسلي، تمييع محلول MLT-827 للمخزون مع متوسطة للوصول إلى تركيز 8 ميكرومولار في خطوة واحدة.
تنفيذ ست خطوات 1:5 تخفيف المسلسل باستخدام المتوسطة مع 0.08٪ DMSO. للتحضير لاختبارات جرعة واحدة، تمييع MLT-827، AFN700، ومجمع 11 حلول المخزون مع المتوسطة للوصول إلى تركيز 4 ميكرومولار في الذهابة واحدة. أولاً، أضف 2 مل من الماء الخالي من السموم المعقمة إلى 10 ملغ من Zymosan المنضب.
دوامة هذا الحل الأسهم لتجانس ذلك. Aliquot الحل ومن ثم تخزين aliquots في 20 درجة مئوية. في هذه الدراسة PBMCs الإنسان والخلايا الطحال الماوس يتم تحفيز مع إما Zymosan المنضب، وهو ناهض Dectin-1، أو lipopolysaccharide، ناهض TL4.
يتم قياس NNF ألفا الافراج في عظمى بعد 20 ساعة. في كل من البشر والفأر مقايسات المركب MLT-827 كتل انتقائية إنتاج ألفا TNF مدفوعة مسار Dectin-1 ولكن ليس من قبل مسار TLR4. في أحادية حفز مع LPS، وإنتاج ألفا TNF هو إلغاء تماما تقريبا من قبل AFN700 لكنه ليس حساسا لCpd11، وهو ما يتفق مع اعتماد مسار TLR4 على NF-كابا B النشاط وديمومة على النشاط SIC.
وعلى النقيض من ذلك، فإن إنتاج TNF ألفا الذي يقوده ديكين-1 وMODCs يظهر حساسية تجاه MLT-827 وAFN700 وCpd11. ويقدم ذلك أدلة إضافية على تورط سلسلة تعاقبية لإشارات SIC CBM في مسار Dectin-1. كما أن إنتاج IL-1 بيتا و IL-6 و IL-23 حساس أيضاً للمثبطات الثلاثة، مما يشير إلى آليات تنظيمية مماثلة لـ TNF alpha.
ومع ذلك، فإن التأثير المحدود الذي شوهد على إنتاج IL-8 يشير إلى أن هذا السيتوكين لديه آلية تنظيمية متميزة. رفع Trehalose-dibehenate تركيزات فوق 50 ميكروغرام لكل مل يؤدي إلى إنتاج TNF ألفا, IL-6, و IL-1 بيتا, التي تعتمد على نشاط الباركاسال1 MALT1 وفقا لتأثير منع MLT-827. وقد شوهدت نتائج مماثلة عند تحدي الـ MODCs مع زيادة تركيزات Zymosan المنضب لتحفيز ديكتين-1.
جعلت هذه الطريقة من الممكن أن تظهر أن مالتكالباس paracaspase ينظم بشكل انتقائي C-نوع الليكتين مثل مستقبلات الإشارات. من الضروري استخدام مركبات مرجعية تتميز بشكل جيد. إيلاء الاهتمام لإجراء لتخفيف حلول الأسهم.
وهذا أمر بالغ الأهمية للمجمع مع قابلية الذوبان المحدودة.
