Las placas amiloides son necesarias para el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer. Sin embargo, no son suficientes. A pesar de este hecho, siguen siendo enigmáticos debido en parte a los desafíos en la caracterización de sus contenidos.
Nuestro protocolo es altamente eficiente para aislar fibrillas amiloides de alta pureza y es muy adecuado para comprender los detalles finos de la estructura y la composición. Conocer el contenido de proteínas de las placas amiloides puede ayudar a identificar los objetivos de la intervención terapéutica que pueden retrasar, interferir o prevenir su acumulación. Por lo tanto, retrasar el inicio de la enfermedad.
Este método es muy adecuado para extraer depósitos de proteínas de tejidos cerebrales degenerados y agregados de proteínas en diferentes otras vías de proteínas. Comience colocando una región de tejido cerebral recién diseccionada o congelada en un tubo de dos mililitros que contenga de seis a ocho cuentas de cerámica en un tampón de homogeneización helado recién preparado. Luego muele el tejido usando un homogeneizador de molino de cuentas a 4, 000 rpm con dos ciclos de 30 segundos de pulso de encendido y apagado.
Ahora agregue nueve mililitros de tampón de homogeneización helada al mililitro de homogeneizado de tejido cerebral y un tubo y sello de 15 mililitros con tiras de película de cera de laboratorio. Para garantizar una solubilización robusta, mantenga el tubo girando durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, agregue sacarosa sólida a la suspensión de extracto de tejido a una concentración final de 1.2 moles.
Mezclar bien y la centrífuga tuvo 250.000 x g durante 45 minutos a cuatro grados centígrados. Después de desechar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet en dos mililitros de tampón de homogeneización que contenga 1.9 sacarosa molar triturando y centrifugando a 125, 000 x g durante 45 minutos a cuatro grados Celsius. Después de la centrifugación, transfiera la capa sólida blanca superior a un tubo fresco y solubilice un mililitro de tampón de lavado helado acariciando hacia arriba y hacia abajo varias veces.
Dado que el pellet también está enriquecido con fibrillas amiloides, deseche la capa media acuosa y combine el pellet con la capa superior para un mayor rendimiento. Centrifugar las fracciones combinadas a 8.000 x g durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. Después de desechar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet en un mililitro de tampón de digestión helada e incube a temperatura ambiente durante tres horas en un vórtice.
Centrifugar la muestra de nuevo, luego lavar el pellet dos veces en un mililitro de tampón Tris helado y centrifugar de nuevo. Después del segundo lavado, vuelva a suspender el pellet en un mililitro de tampón de solubilización mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo y centríe rápidamente el tubo a 200, 000 x g durante 60 minutos a cuatro grados Centígrados. Guarde el pellet, luego reduzca la concentración de sacarosa de 1.3 a un molar agregando un tampón Tris milimolar 50 milimolares al sobrenadante.
Centrifugar el sobrenadante de nuevo, luego disolver tanto los gránulos como 100 microlitros de tampón Tris que contienen 0.5% SDS. Para la purificación amiloide, solubilice los gránulos ricos en amiloide utilizando ondas de ultrasonido en un dispositivo de sonicación de baño durante 20 ciclos, luego centríe inmediatamente el material a 20, 000 x g durante 30 minutos a cuatro grados Celsius. Vuelva a suspender el pellet en 500 microlitros de tampón 0.5% SDS Tris y repita el lavado cuatro veces más, Después del paso de centrifugación final, lave el pellet en 200 microlitros de agua ultrapura y centrífique 20, 000 x g durante 30 minutos a cuatro grados Celsius para eliminar cualquier detergente restante.
Disuelva el pellet final que contiene fibrillas amiloides purificadas en 100 microlitros de agua ultrapura. Disuelva bien los 100 microlitros purificados de fibrillas amiloides en 400 microlitros de metanol y vórtice. Luego mezcle 100 microlitros de cloroformo y vórtice nuevamente.
A continuación, agregue 300 microlitros de agua ultrapura y vórtice a fondo. Después de la centrifugación a 12, 000 x g durante dos minutos a temperatura ambiente, retire cuidadosamente la capa acuosa superior sin perturbar la capa de interfaz que contiene la escama de proteína y agregue el mismo volumen de metanol nuevamente. Repita la centrifugación, deseche el sobrenadante y seque al aire el pellet.
Para la digestión, disuelva el pellet en 50 microlitros de tampón de clorhidrato de guanidina y sonicato en un baño de agua helada. Luego vórtice a fondo durante 45 minutos a una hora a temperatura ambiente, agregue 50 microlitros de solución de surfactante al 0.2% y vórtice nuevamente durante otros 60 minutos. A continuación, agregue un microlitro de TCEP de 500 milimolares e incube durante 60 minutos.
Luego agregue dos microlitros de yodoacetamida milimolar de 500 e incube en la oscuridad durante 20 minutos. Después de la incubación, apague la yodoacetamida con cinco microlitros de solución de TCEP durante 15 minutos. A continuación, agregue el volumen requerido de solución de bicarbonato de amonio milimolar de 50 milimolares al tubo para reducir la concentración de guanidina a 1.5 moles.
Además, agregue una solución de surfactante al 1% al tubo. Luego agregue tripsina y deje el tubo mezclando a 37 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, agregue ácido fórmico a la solución peptídica digerida para reducir el pH a 2.0, luego active la columna de espín C18 agregando 200 microlitros de solución de metanol al 50% e hilando a 1500 x g durante dos minutos a temperatura ambiente.
A continuación, equilibre los lechos de resina de columna C18 agregando 200 microlitros de tampón de equilibrio y girando nuevamente durante dos minutos. Después del equilibrio, cargue la solución peptídica acidificada en la columna C18 y centrífuga a 1500 x g durante dos minutos a temperatura ambiente. Vuelva a cargar el flujo, gire la columna y descarte el segundo flujo.
Luego lave los péptidos unidos a la resina C18 dos veces con el tampón de lavado. Eluya el péptido tres veces agregando 40 microlitros de tampón de elución y centrifugando la columna. Seque los péptidos en un concentrador de vacío de velocidad evaporando la solución acuosa.
Los gránulos secos se pueden guardar a 20 grados centígrados durante unas semanas antes del análisis de EM. La tinción roja del Congo de amiloides purificados documenta el enriquecimiento de las fibrillas amiloides en comparación con la fracción soluble de SDS. La fracción soluble de SDS no mostró la presencia de amiloides.
La estructura de las fibrillas purificadas confirmó la presencia de fibrillas amiloides casi puras. Además, el marcado de inmunogold confirmó la presencia de péptidos beta-42 amiloides. La tinción con anticuerpos anti-beta-amiloide beta-42 y anti-fibrilla mostró una abundancia relativa de péptidos beta-42 amiloides en las fibrillas.
Las fracciones de amiloide purificado mostraron la presencia de aproximadamente 250 proteínas, mientras que la fracción recolectada antes de la ultrasonicación y el lavado de SDS contenía más de 2, 500 proteínas. Los núcleos de fibrillas mostraron enriquecimiento de proteínas asociadas con orgánulos no unidos a la membrana y complejos supramoleculares. Los amiloides son especies de baja abundancia, tal vez de unos pocos picogramos a pocos microgramos por miligramo de tejidos cerebrales.
Por lo tanto, debe tener mucho cuidado al recoger las capas, paletas o desechar el sobrenadante. Con el desarrollo de esta técnica, ahora puede identificar con más confianza las proteínas asociadas con las semillas amiloides iniciales, caracterizar su estructura y dirigirse a ellas para la intervención terapéutica. Por lo tanto, prevenir la aparición de esta enfermedad mortal.
