Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la investigación básica y aplicaciones clínicas, como la investigación del cáncer y el tratamiento del cáncer, pero también en el campo de la inmunología. La principal ventaja de este método es que es un método estático y fácil de facilitar. Esta técnica es capaz de identificar automáticamente los tipos de células enfermas en función de su forma y características de movimiento.
Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el diagnóstico y la terapia del cáncer o enfermedades inflamatorias. Este método puede proporcionar información sobre las acciones entre las células inmunitarias y las células cancerosas, pero también se puede aplicar en cualquier campo donde sean necesarios datos de microscopía tridimensional. Puede ser que los individuos nuevos en este método lucharán debido a sus problemas para describir y validar los datos de microscopía tridimensional.
Pensamos que una demostración visual de este método es crítica porque las herramientas de software que utilizamos aquí no son familiares para muchos de los científicos. Para empezar, obtenga un conjunto de datos de microscopía tridimensional de alta resolución y desconvolucionado como se describe en el protocolo de texto adjunto. Cargue los datos de imagen 3D en el software de reconstrucción y comience a crear una superficie 3D para cada objeto.
Para ello, seleccione la opción Vista 3D y haga clic en Superficies y, a continuación, haga clic en el botón Siguiente para continuar con el Asistente para creación de superficies. Ahora, seleccione el canal de imagen para la reconstrucción de la superficie. Elija un valor de suavizado que no oculte los detalles de la superficie, pero también evite superficies porosas.
Aplique la función de suavizado haciendo clic en la casilla de verificación de opción suave y proporcionando un radio de suavizado. Al crear construcciones de imágenes tridimensionales de datos de microscopía, es especialmente importante prestar atención al factor de suavizado y al método de umbral adecuado, con el fin de no perder ninguna característica o forma celular. A continuación, seleccione el método de umbral para buscar las superficies.
Utilice un umbral de intensidad absoluta cuando los objetos, como los que se muestran aquí, estén bien separados del fondo y tengan un nivel de brillo aproximadamente uniforme. Cuando los objetos varían en su intensidad pero todavía se pueden separar del fondo local y de los otros objetos que los rodean, aplique un umbral de contraste local. Establezca el área de búsqueda de umbral local según el valor del diámetro esperado de los objetos reconstruidos.
A continuación, seleccione de una lista de opciones para filtrar las superficies reconstruidas según los parámetros morfológicos de interés. Esto incluye volumen, esfericidad, relación superficie-volumen y más. Guarde y exporte las superficies generadas en un formato como VRML, que sea compatible con el software de animación 3D que se utilizará en el siguiente paso.
Inicie Blender y vaya a la pestaña Salida en el lado derecho de la ventana. Seleccione el formato TIFF en el menú desplegable y establezca la Profundidad de color en RGBA de 8 bits. A continuación, cambie al modo de scripting y vaya al archivo de script proporcionado Titled:GUI_Autorotate.
py, que se puede descargar desde el repositorio github para este trabajo. De vuelta en la ventana principal, haga clic en Ejecutar script y elija la carpeta de los archivos wrl cuando se le solicite la entrada. A continuación, vaya al menú predeterminado.
Aquí, establezca las rotaciones en un valor en o por encima de seis. Ejecute el script haciendo clic en el botón Rotar. Una rotación de seis ángulos diferentes suele ser suficiente para distinguir las diferentes poblaciones celulares, sin embargo, no recomendamos utilizar menos de seis rotaciones, con el fin de no perder ninguna información sobre formas o características.
Guarde las proyecciones de las superficies individuales en la misma carpeta que se utilizó para la entrada. De forma predeterminada, las imágenes se guardan en un formato TIFF de 8 bits, que es el formato requerido por el plugin FIJI, Shade. Abra Fiji y seleccione Sombrear en el menú Plugins.
Comience con los valores predeterminados y ajuste los parámetros más adelante. Haga clic en Aceptar cuando esté listo para ejecutar el programa. A continuación, elija la carpeta de origen que contiene los archivos TIFF que se crearon en la sección anterior y haga clic en Seleccionar.
A continuación, proporcione una carpeta de datos de salida. Cuando aparezca la primera imagen, dibuje un rectángulo que rodea la celda y comience haciendo clic en Aceptar. A medida que se ejecuta el plugin, se ve el preprocesamiento de la imagen en el hallazgo de la periferia de las celdas indicadas por las líneas rojas.
Las coordenadas de las aristas encontradas se utilizan ahora para calcular los componentes discretos de cuatro más. Para entrenar mapas autoorganizantes por primera vez, comience cargando MATLAB. Cargue el script TrainSOM MATLAP y, a continuación, seleccione Ejecutar para iniciar el entrenamiento.
Asegúrese de tener correctamente la ruta del archivo si es necesario. Cuando empiece a ejecutarse, aparecerá una ventana adicional para mostrar el progreso. Espere hasta que se complete el entrenamiento antes de continuar.
De forma predeterminada, el script se establece para ejecutar 2.000 iteraciones o épicas. Una vez finalizado el entrenamiento, examine las gráficas de topología de la red. A continuación se muestra un ejemplo de la gráfica de distancias de vecino, la gráfica de aciertos de muestra y la gráfica de planos de entrada.
Los mapas autoorganizadores son una herramienta importante para descubrir relaciones ocultas en el conjunto de datos. Agrupan los datos de forma objetiva y tienen la ventaja de que no necesitan un conjunto de datos de entrenamiento, ya que aprenden sin supervisión. La red está ahora entrenada.
Haga clic con el botón derecho en el archivo de su área de trabajo y guárdelo para su uso futuro. Cargar en los mapas autoorganizantes, cuando se utiliza un mapa ya entrenado, con el fin de agrupar un conjunto de datos. A continuación, importe el archivo CSV que se va a probar con los mapas entrenados precargados.
Aquí, seleccionaremos la salida CSV del complemento de sombra. Cuando se carguen los datos, cambie el tipo de salida a Matriz numérica y, a continuación, seleccione Importar selección. Una vez finalizada la clasificación, utilice la ventana de comandos para evaluar los distintos trazados.
La muestra de imagen aquí es de un conjunto de datos decroscopia multitográfica intravital desconvolucionado de células microgliales. En condiciones fisiológicas, la microglia presentaba una forma bastante compleja con múltiples procesos altamente ramificados. Cuando se coloca en un ambiente canceroso, como este modelo tumoral cortical, la microglia cambió a una forma más simple y similar a un husillo.
20 de estos componentes de descripción en forma de forier se utilizaron como entradas para entrenar el mapa autoorganizador. El mapa entrenado fue probado con el fin de evaluar su capacidad para distinguir entre células sanas y cancerosas. La población de células sanas se proyectó en una sola área que se muestra aquí, mientras que el conjunto de datos de microglia cancerosa se presentó como una región activa en forma de mancuerna.
Los mapas también pueden ser entrenados por expertos médicos para identificar grupos celulares distintos. Aquí, las células en reposo, las células fagocíticas, las células que interactúan y las células móviles, fueron identificadas, reconstruidas y utilizadas para entrenar un mapa de 12x12. Este mapa combinado muestra grupos de neuronas artificiales de alto valor, especialmente en las áreas inferior izquierda y media del mapa.
La robustez del enfoque de asignación se probó mediante el mapa autoorganizador entrenado con 3 subconjuntos aleatorios del mismo tipo de celda en reposo que no formaba parte del conjunto de datos de entrenamiento. La respuesta del S.O.M a esta entrada exhibe una respuesta muy similar que indica el tipo de celda correcto. Después del desarrollo de esta técnica, ahora tenemos un kit de herramientas, con el que simplemente podemos categorizar los cambios en la forma de las células.
Estos cambios ocurren, durante el cáncer, por ejemplo, u otras respuestas del sistema inmunitario, y podemos medirlos con microscopía, usando animales enteros, tejido extirpado, o incluso órganos en el chip.
