Estos métodos pueden ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurología y la oftalmología, y ayudar a evaluar una gran variedad de retinopatías y manifestaciones de la retina en varios modelos de roedores. La principal ventaja de estas técnicas es que se pueden realizar investigaciones longitudinales no invasivas, reduciendo la variabilidad y reduciendo el número de animales necesarios para los experimentos. Estos métodos permiten la investigación cuantitativa in vivo de la estructura y la función que se pueden utilizar para investigar las condiciones patológicas, o para evaluar la utilidad potencial de las nuevas terapias.
Sin embargo, especialmente la aplicación de la tecnología de tomografía de coherencia óptica en los modelos de roedores sigue siendo difícil, principalmente debido al tamaño de los ojos pequeños. Demostrando los procedimientos estará Michael Dietrich, un estudiante de doctorado de nuestro laboratorio. Después de anestesiar el roedor, aplicar una gota de fenilefrina tropicamida en cada ojo para la dilatación pupilar.
Limpie el exceso de gotas húmedas después de un minuto. Y lubricar los ojos metilcelulosa a base de gel oftálmico para evitar secar el ojo y crear una córnea turbia. Luego usa fórceps para colocar una lente de contacto personalizada en el ojo.
Pulse el botón Inicio en la esquina derecha de la pantalla del panel de control para iniciar el modo de adquisición. A continuación, para imaginar el ojo izquierdo, coloque el soporte para asegurarse de que la bombilla del ojo izquierdo del roedor se enfrenta a la cámara. Establezca el nivel de filtro en R y seleccione BR y OCT para reflejos azules fundus imaging y B-scan acquisition en el software.
A continuación, ajuste la distancia de enfoque a aproximadamente 38 dioptrías, utilizando la perilla de enfoque en la parte posterior de la cámara. Y acerca la retina, hasta que la exploración OCT sea visible en la pantalla. A continuación, para asegurar un camino de haz a través del centro de la pupila, con un ángulo ortogonal de la retina en todos los planos, coloque el disco óptico en el centro del campo iluminado.
Y ajuste la línea horizontal y vertical B-scans a un nivel horizontal girando el soporte. En la pantalla del software, seleccione el modo de escaneo de volumen y establézcalo en 25 B-scans en modo de alta resolución a 50 seguimientos automáticos en tiempo real. Centre el centro de la cuadrícula de escaneo de volumen en el disco óptico e inicie la adquisición presionando la perilla de sensibilidad negra, y luego Adquiera en el panel de control.
Una vez completada la adquisición, establezca el nivel de filtro en A.Seleccione Autofluorescencia azul en el panel de control. Y ajuste el brillo de la imagen con la perilla de sensibilidad. Presione la perilla de sensibilidad y luego Adquiera para poner a prueba las celdas fluorescentes o los depósitos autofluorescentes.
Para el análisis de los análisis de volumen, utilice la segmentación automatizada del software del dispositivo OCT haciendo clic con el botón derecho en el análisis. Y seleccione Segmentación y, a continuación, Todas las capas. Realice la corrección manual de las capas haciendo doble clic en el escaneo deseado.
Seleccione Perfil de espesor. Y haga clic en Editar segmentaciones de capas. Seleccione una capa a la vez.
Y si es necesario corrija la línea verde moviendo los puntos rojos arrastrando y soltando a la posición correcta. A continuación, seleccione la pestaña Mapa de espesor. Elija la cuadrícula ETDRS de 1, 2, 3 milímetros.
Centre el círculo interior en el disco óptico. Por último, calcular el espesor de las capas de retina a partir de los valores de espesor proporcionados por el software para los diferentes sectores de la retina de interés. Para calcular los valores de espesor principales de los escaneos de volumen, utilice toda la cuadrícula ETDRS de 1, 2, 3 milímetros que cubre un ángulo de aproximadamente 25 grados, excluyendo el círculo interno de un milímetro que contiene el disco óptico.
Comience seleccionando una plataforma para medir los roedores. Abra la ventana Ajustes preajustes haciendo doble clic en el software. Seleccione Nuevo grupo y elija el nombre del grupo, el número de sujetos, las especies y las cepas.
Seleccione un estímulo variable, frecuencia espaciotemporal, sensibilidad al contraste, velocidad u orientación en el menú desplegable y pulse Crear nuevo grupo. Concéntrese en la plataforma manipulando el anillo de enfoque de la cámara en la parte superior de la cámara. Y calibrar el sistema alineando el círculo rojo alrededor del círculo negro en la plataforma.
A continuación, coloque el roedor en la plataforma y déjelo adaptarse al entorno durante unos cinco minutos. A continuación, inicie la medición seleccionando la flecha izquierda para sí o el cuadrado para no, si el animal rastrea o no realiza un seguimiento respectivamente. Seleccione manualmente el tamaño del paso del estímulo haciendo clic en las flechas arriba y abajo junto al estímulo variable.
Por último, seleccione la pestaña Resumen y haga clic en Archivo, Exportar tabla o Gráfico para exportar el conjunto de datos deseado. Los resultados indican que la degeneración de las capas internas de la retina se reduce. Y una puntuación clínica EAE se atenúa durante el curso EAE cuando se administró la sustancia 1.
Además, OKR revela una mejor agudeza visual de los animales tratados con la sustancia 1 en comparación con los ratones MOG EAE no tratados medidos por pruebas de umbral de frecuencia espacial durante un período de 120 días. Al realizar mediciones de PTU, un paso crítico es la orientación ortogonal del rayo láser en todos los planos en relación con la retina para garantizar la calidad y reproducibilidad de los valores de espesor. Para la técnica OKR, distinguir entre el seguimiento y los movimientos conductuales normales del animal, requiere cierto entrenamiento del investigador.
Es importante ser cegado para el grupo experimental. Después de estas investigaciones de daños estructurales y funcionales que ocurren en el contexto de la encefalomielitis autoinmune experimental, el procedimiento también puede ser útil en otros modelos que involucran el sistema visual, incluyendo pero no limitado a los modelos de retinopatías, o lesión del nervio óptico. Estas técnicas allanan el camino para la investigación in vivo en los campos de la neurología y la oftalmología y son fácilmente transferibles a los ensayos clínicos.
