Apoyo financiero para la mayoría de los estudios fue proporcionado por el Consejo Sueco de Investigación Médica (subvención 5942).

1. Los animales <ol><li> Pequeños roedores, como ratas, ratones y cobayas, se han utilizado como modelos animales. Por desgracia, los ratones adultos (muchas cepas de ratón han sido evaluados) tienden a carecer o tener sólo un número muy bajo de potencial de los padres microvasos (a partir de que la angiogénesis puede originar) dentro de sus ventanas mesentérica, lo que hace que los estudios con ratones confiable. Por lo tanto, el ensayo ha sido desarrollado principalmente para las ratas. </li><li> Las ratas, que están aclimatados a un medio ambiente normal durante al menos 7 días después de la entrega del criador, suelen alojarse en parejas en una jaula estándar en un 12 hr luz / oscuridad ciclo con acceso libre al agua y pellets. Cada animal está marcada. Utilizamos principalmente ratas adultas jóvenes (por lo general 7-10 semanas de edad de las distintas cepas, pero las ratas Sprague-Dawley, generalmente de sexo masculino, en las ratas más jóvenes de 5-6 semanas de edad el número de microvasos nativos tienden a ser bajos) obtenidos de diversos criadores. En el período anterior a la prueba y durante todo el experimento, se pesan los animales cada dos días, y siempre en el día del sacrificio. Cuando los animales son tratados de forma concurrente ip (para la inducción de la angiogénesis, ver abajo) y sc o iv o po, se pesan cada día. Esto permite el establecimiento de grupos experimentales y de control del peso corporal igual al comienzo del experimento, y permite el seguimiento de la influencia del tratamiento en el cuerpo, aumento de peso durante el transcurso del experimento. Dado que las ratas macho adultas creciendo sólidamente fisiológicamente (ganando aproximadamente 40 a 60 g por semana, dependiendo del tipo de cepa), la ganancia de peso retraso es un marcador sustituto sensibles de toxicidad, sistémica el bienestar, la anorexia, y la falta de desarrollo. </li></ol> Trabajamos en una instalación para animales de alto nivel de atención y un esfuerzo considerable para reducir al mínimo los niveles de estrés experimentado por los animales. Las directrices éticas actuales, son los establecidos por Workman P. et al. (Directrices para el bienestar y el uso de animales en la investigación del cáncer. Br. J. Cáncer 102, 1555-1577, 2010). El Comité de Ética Animal de la Universidad de Gotemburgo aprobó estos estudios. 2. Pro-angiogénicos tratamiento intraperitoneal <ol><li> El candidato pro-angiogénicos factor a ser probado se disuelve y se diluye en la endotoxina libre de solución salina utilizada para la perfusión de los pacientes (incluso en niveles extremadamente bajos, la endotoxina es pro-angiogénico). Todas las soluciones están formadas por recién en el día de la inyección, esterilizada por filtración (Millipore 0,22 micras de filtración), se verificó su pH neutro (7,1-7,3), y se utiliza a temperatura ambiente. El agente de prueba se inyecta en concentraciones bajas o muy bajas. Por ejemplo, la rata rVEGF 164 (564-RV/CF, R &amp; D Systems Europe, Ltd., Oxon, Reino Unido), que es el VEGF-A isoforma predominante en ratas, se diluye a 96 pmol / ml de solución salina libre de endotoxinas, congelados y descongelado y un volumen de 5 ml se inyecta ip en la rata. Nosotros usamos una jeringa de 5 ml con aguja de 0,8 mm (aguja verde, 21G) para la inyección ip. Este tratamiento, dos veces al día durante 4,5 días, es decir., Desde la mañana del lunes (día 0) hasta la mañana del viernes (día 4), ​​induce una respuesta contundente al surgimiento de la angiogénesis en el tejido mesentérico prueba, alcanzando un máximo alrededor del día 21. La administración de la solución IP se asegura de que todo el volumen se entrega en la cavidad peritoneal (y no en los intestinos, la vejiga o cualquier otro órgano). La inyección rápida de 5 ml permite la confirmación táctil por el operador que el chorro de fluido ha pasado a través de la pared abdominal en la cavidad abdominal. Siguientes, antes o simultáneamente con la ip pro-angiogénicos tratamiento, cualquier agente de la prueba de elección puede administrar por vía sistémica. </li></ol> 3. Administación sistémica de la angiogénesis, la modulación de los agentes <ol><li> Cualquier otra vía que la vía IP se pueden utilizar, ya que el tratamiento ip puede afectar a la reacción en curso angiogénicos a través de la inducción de la inflamación o posiblemente por la activación de los mastocitos en el tejido de prueba, que puede conducir a un fuerte pro-angiogénicos respuesta. Además de la administración oral o inyección única subcutánea o intravenosa, a menudo utilizamos la administración subcutánea utilizando minibombas osmóticas (uno o más, con diferentes volúmenes de bombeo y los tiempos) para ofrecer la solución a una velocidad constante durante un máximo de dos o varias semanas. </li><li> Infusión subcutánea continua de los agentes de pruebas Llenado y la implantación de minibombas osmóticas Por lo general, el día 5, es decir, un día después del final del tratamiento con VEGF ip, minibombas osmóticas (por ejemplo, el modelo 2ML2, con velocidad constante bombeo de 5,0 l / h de 14 a 15 días; Alzet bombas osmóticas, Mountain View, CA , EE.UU.) se llenan en condiciones estériles con el agente de ensayo o el vehículo apropiado. Después de un almacenamiento en estéril al 0,9% (w / v) NaCl la noche a 37 ° C, la bomba (s) se implantan quirúrgicamente sc en la espalda (en el lado de la columna vertebral Column en la región de la escápula) de las ratas que han sido anestesiados con gas isoflurano (veterinario Isoba, Schering-Plough Animal Health, Merck &amp; Co., Inc., Whitehouse Station, NJ, EE.UU.), inicialmente en una cámara transparente y hermético Posteriormente, a través de una máscara (para minimizar el estrés causado al animal siguiente, la cámara se llena con aire antes de que se reutiliza). La incisión de la piel hecha para la implantación de la bomba se sutura inmediatamente después de la implantación del uso de hilo de seda. Puesto que los animales el aumento de peso fisiológicamente durante el período experimental y los agentes de prueba se administra a una velocidad constante, la dosis real seleccionado para una prueba de drogas por kg de peso corporal es superior a la dosis media al comienzo del período de infusión y es menor que la dosis media al final del periodo de perfusión. La infusión continua, como se describe aquí, puede ser visto como una forma extendida de tratamiento metronómica. </li></ol> 4. Poner fin a la experimentación <ol><li> Un animal a la vez que se coloca en una cámara hermética transparente, que se llena con gas CO2, que rápidamente se mata al animal. La cámara se purga con aire antes de ser utilizados de nuevo. </li></ol> 5. La recolección de muestras de tejido <ol><li> Como se muestra en el DVD, la pared abdominal se abre, y el mesenterio del intestino pequeño es identificado, incluyendo la parte más distal que llega a la válvula íleo-cecal (la unión del intestino delgado y el intestino grueso). Cuatro (o más) de los más distal localizado &quot;ventanas&quot; se numeran y se extendió hacia el objetivo estándar sin tratar Superfrost Plus diapositivas (Dako Denmark A / S, Glostrup, Dinamarca). Es importante evitar en lo posible, la contaminación de las muestras con contenido de sangre intestinal, u otros fluidos corporales, ya que estos materiales se pueden teñir de forma no específica, aunque esto no invalida la posterior visualización inmunohistoquímica de microvasos. </li><li> Cada muestra ventana mesentérica con el segmento de intestino delgado es adjunta extiende sobre un portaobjetos y se secan a temperatura ambiente durante 20 minutos. Entonces, el tronco intestinal se corta, mientras que las muestras intactas membranosa mesenterio se almacenan a -20 ° C durante períodos prolongados. Esto se muestra en el DVD. </li></ol> Cabe mencionar que la vascularización del tejido y las patentes se puede visualizar antes de la cosecha con la transmisión de microscopía intravital luz. 6. Protocolo para la tinción inmunohistoquímica de microvasos <ol><li> Día 0 Las muestras se dejan descongelar de -20 ° C a la temperatura ambiente, se seca en un armario a los 60 ° C durante 1 hora, y se mantiene a temperatura ambiente durante la noche. </li><li> Día 1 Colocar los portaobjetos en la tinción de los titulares de diapositivas (en cada segunda pista) en una cubeta y lavar dos veces con TBS (pH 7,8) durante 10 minutos a temperatura ambiente. La solución se desecha y se sustituye por la siguiente solución, y así sucesivamente para todos los pasos siguientes. </li><li> Tripsina tratamiento Llene el recipiente de tinción que albergará el soporte de diapositivas tinción con solución de tripsina (25 ° C durante 20 minutos). Deseche la solución e incubar dos veces con solución de sacarosa al 2,5% (a temperatura ambiente durante 10 minutos cada vez). Deseche la solución y aclarar un par de veces en agua destilada (a temperatura ambiente durante unos minutos cada uno). </li><li> Bloqueo de Llene el recipiente de tinción que albergará el soporte de diapositivas tinción con 0,5% de H 2 O 2 en metanol (temperatura ambiente durante 30 minutos). Deseche la solución y enjuagar con agua destilada (a temperatura ambiente durante unos minutos). Deseche la solución y enjuagar dos veces con TBS (pH 7,4) (temperatura ambiente durante 8 minutos cada vez). </li><li> Incubación Todas las incubaciones se encuentran en una cámara húmeda a temperatura ambiente. Alrededor de 150 l de cada una de las soluciones que se indican a continuación se utilizan en cada diapositiva. Las diapositivas se colocan en una cámara húmeda y las soluciones son pipeta en las muestras (las partes no membranoso no tiene que ser cubierto por las soluciones). Para cada uno de los siguientes pasos, cuidadosamente deshacerse de toda la solución antes de que la solución posterior, se añade. <ol><li> Incubación con el normal (bloqueo) en suero (caballo) (ABC kit) 3 gotas de solución de color amarillo / 10 ml de tampón de dilución durante 20 minutos. </li><li> Incubación con el anticuerpo primario ARU0181, que las etiquetas de rata células endoteliales vasculares. El anticuerpo se diluye 1:600 ​​con tampón de dilución (Biosource) (100 l diluido 40 veces [congelado] más 900 l de tampón de dilución) y la incubación se lleva a cabo la noche a 4 ° C. </li></ol></li><li> Día 2 Las diapositivas se retiran de la cámara húmeda, el anticuerpo primario se descarta y las diapositivas se colocan en un portaobjetos de tinción, que se sumerge en la cubeta y se lavaron dos veces con TBS(PH 7,8) durante 8 minutos. <ol><li> La incubación con anticuerpos con biotina (ABC kit) Las diapositivas se colocan horizontalmente en una cámara húmeda y se incubaron con 1 gota de solución de azul / 10 ml de tampón de dilución durante 30 minutos. Deseche la solución y colocar los portaobjetos en un soporte de diapositivas tinción sumergido en la cubeta y lavar dos veces con TBS (pH 7,4) durante 8 minutos. </li><li> La incubación con el reactivo ABC Las diapositivas de nuevo en posición horizontal en una cámara húmeda y las soluciones siguientes pipeta en la parte membranosa de las muestras: 2 gotas de solución de naranja y 2 gotas de solución de TBS marrón / 10 ml (pH 7,4) durante 30 minutos. Mezclar cuidadosamente 30 minutos antes de usar! Deseche la solución y coloque las diapositivas en el soporte de diapositivas en la cubeta y lavar dos veces con TBS (pH 7,4) durante 8 minutos. </li></ol></li><li> La tinción con DAB (0,05%) Este paso debe realizarse en una campana de ventilación química! Coloque las diapositivas y añadir el 3,3-diaminobencidina (DAB, Sigma-Aldrich) solución con una pipeta: solución al 0,1% en TBS DAB (pH 7,4) [congelado] se diluye 1:1 con una mezcla de 10 l H 2 O 2 y 7,5 ml de TBS (pH 7,4). Esta solución es esterilizada por filtración antes de su uso (para eliminar cualquier partícula que pueda oscurecer la imagen microscópica). Tinción de las muestras durante 8 minutos. Deseche la solución y coloque las diapositivas en el soporte de diapositivas manchas sumergidas en el tarro de las manchas. Enjuague con agua corriente y luego en agua destilada durante unos minutos. </li><li> Deshidratación Las diapositivas se mantienen en el soporte de diapositivas manchas. Enjuague por desechar y volver a llenar la jarra de tinción con agua destilada / etanol: agua destilada, alcohol al 70%, 95% de alcohol, alcohol absoluto, con 2 minutos en cada solución. </li></ol> 7. Imágenes y Evaluación de la red microvascular en cada muestra la ventana mesentérica Después de la tinción inmunohistoquímica de las células endoteliales vasculares Como se muestra en la película, los microvasos son microscópicamente visualizar in situ en el tejido intacto. <ol><li> En primer lugar, se utiliza un microscopio de dibujo con rango de aumento 14 a 34 (Leica M salvaje 3Z) a lápiz sobre papel blanco el área de la ventana entera, así como toda la zona vascularizada (VA) por la ventana mesentérica. VA, como porcentaje de toda el área, es fácil de medir mediante planimetría computerizada o no informáticos (o simplemente cortando y ponderación de la imagen de toda la ventana, y las imágenes de todas sus partes vascularizado). </li><li> El uso de otro microscopio de dibujo, los perfiles individuales de microvasos, que se identifican con facilidad, se dibujan en negro de tinta sobre papel blanco de 80 aumentos en los campos elegidos al azar. Este es el punto de partida para la posterior evaluación computarizada morfométrico de la longitud de complicaciones microvasculares (MVL), que es básicamente una medición de la densidad microvascular. </li><li> Opcionalmente, las variables relacionadas con la formación de patrones microvasculares, así como los de la evaluación del número de brotes microvascular y la longitud de cada uno de los brotes microvascular (N º SP y Le. SP, respectivamente) se puede determinar. -El contraste óptimo entre las estructuras de los vasos representado negro y el fondo blanco facilita el análisis detallado de las imágenes en la mayoría de los programas comerciales computarizados morfométricos. </li><li> En la mayoría de los casos, las variables más importantes son VA y MVL, que cuando se multiplica en conjunto generan la longitud total de microvasculares (TMVL). </li></ol> 8. Análisis estadístico Por lo general, utilizan el estándar no paramétrico de Mann-Whitney U-test para analizar impares (dos colas) observaciones. Un promedio de cuatro ventanas mesentérica por animal se utiliza como punto de datos independientes para cada variable de la ventana mesentérica. El criterio de significación estadística p ≤ 0,05.

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	<li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+models+of+angiogenesis.">In vivo models of angiogenesis.</a> J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).</li><li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+testing+with+angiogenesis+models.">Drug testing with angiogenesis models.</a> Expert Opin. Drug. Discov. 3, 533-549 (2008).</li><li>Norrby, K., Jakobsson, A., Sorbo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast-cell-mediated+angiogenesis:+a+novel+experimental+model+using+the+rat+mesentery.">Mast-cell-mediated angiogenesis: a novel experimental model using the rat mesentery.</a> Virchows Arch. B Cell. Pathol. Incl. Mol. Pathol. 52, 195-206 (1986).</li><li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cells+and+angiogenesis.">Mast cells and angiogenesis.</a> APMIS. 110, 355-371 (2002).</li><li>Albertsson, P., Lennernas, B., Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+meteronomic+chemotherapy:+modulation+of+angiogenesis+mediated+by+VEGF-A.">On meteronomic chemotherapy: modulation of angiogenesis mediated by VEGF-A.</a> Acta Oncol. 45, 144-155 (2006).</li><li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+apo-lactoferrin+enhances+angiogenesis+mediated+by+vascular+endothelial+growth+factor+A+in+vivo.">Human apo-lactoferrin enhances angiogenesis mediated by vascular endothelial growth factor A in vivo.</a> J. Vasc. Res. 41, 293-304 (2004).</li><li>Norrby, K., Mattsby-Baltzer, I., Innocenti, M., &amp;amp, T. u. n. e. b. e. r. g., S, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orally+administered+bovine+lactoferrin+systemically+inhibits+VEGF(165)-mediated+angiogenesis+in+the+rat.">Orally administered bovine lactoferrin systemically inhibits VEGF(165)-mediated angiogenesis in the rat.</a> Int. J. Cancer. 91, 236-240 (2001).</li><li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-molecular-weight+heparins+and+angiogenesis.">Low-molecular-weight heparins and angiogenesis.</a> APMIS. 114, 79-102 (2006).</li><li>Norrby, K., Nordenhem, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dalteparin,+a+low-molecular-weight+heparin,+promotes+angiogenesis+mediated+by+heparin-binding+VEGF-A+in+vivo.">Dalteparin, a low-molecular-weight heparin, promotes angiogenesis mediated by heparin-binding VEGF-A in vivo.</a> APMIS. 118, 949-957 (2010).</li><li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+fibroblast+growth+factor+and+de+novo+mammalian+angiogenesis.">Basic fibroblast growth factor and de novo mammalian angiogenesis.</a> Microvasc. Res.. 48, 96-113 (1994).</li><li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor+and+de+novo+mammalian+angiogenesis.">Vascular endothelial growth factor and de novo mammalian angiogenesis.</a> Microvasc. Res. 51, 153-163 (1996).</li><li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+density+in+terms+of+number+and+length+of+microvessel+segments+per+unit+tissue+volume+in+mammalian+angiogenesis.">Microvascular density in terms of number and length of microvessel segments per unit tissue volume in mammalian angiogenesis.</a> Microvasc. Res. 55, 43-53 (1998).</li></ol>

El ensayo fue presentado en 1986 3 y sucesivamente ha sido desarrollado y perfeccionado en el laboratorio 7,10-12. Como se discutió en los documentos de revisión (invitado) 1, 2, el ensayo se compara bien con otros mamíferos en el ensayo de angiogénesis in vivo en lo que se refiere en particular a las características importantes tales como el tejido de la prueba para adultos es de forma nativa vascularizado y carece de la angiogénesis fisiológica, un traumatismo mínimo, en su caso, se infligidos a los tejidos, y las variables cuantitativas se miden realmente, lo que permite el análisis de estadística sólida relación dosis-respuesta y los estudios moleculares de actividad, la angiogénesis brote ocurre, que es predominante en los tejidos normales y tumores, y los datos de toxicidad se acumula fácilmente en las ratas que crecen robustamente fisiológicamente en la edad adulta. Características desfavorables pueden incluir el hecho de que el ensayo es relativamente lento, especialmente cuando se evalúa el número y la longitud de los segmentos individuales de microvasos y los brotes de microvasos, que no permite observaciones real-time/serial, y que no es adecuado para ratones ya que muchas ventanas mesentérica en ratones carecen de microvasos potenciales padres de nuevos capilares que se pueden originar. Observaciones en tiempo real, sin embargo, posible gracias a la microscopía intravital donde las ventanas mesentérica exteriorizado, pero intacta, son extendidas a lo largo de una platina del microscopio, mientras que el animal esté anestesiado, como se indica en 1. Avances significativos en la investigación de la angiogénesis se han logrado en las últimas décadas el uso de modelos como el micropocket la córnea, la membrana corioalantoidea de pollo, y sc ensayos plug Matrigel, que son herramientas útiles, pero limitado en última instancia. Futuras aplicaciones clínicas de terapias anti-angiogénicas y pro-angiogénicos requieren el establecimiento y validación de los más sensibles y relevantes biológicamente, verdaderamente cuantitativa modelos preclínicos, como la descrita en el informe actual.

Tampones y reactivos 0,5 M Tris-HCl (pH 7,8) solución madre Tris (hidroximetil) aminomethan (60,57 g) se disuelve en ~ 900 ml de agua destilada y ~ 45 ml de HCl 25% (concentrado) se agrega para alcanzar pH 7,8 seguido de dilución a 1 litro con agua destilada. Tris-buffer salino (TBS, pH 7,8) A 200 ml de la solución se añade 18 g de NaCl disuelto en ~ 1800 ml de agua destilada con el ajuste de pH a 7.8 con la solución madre, seguido de dilución de 2 litros con agua destilada. TBS (pH 7,4) A 200 ml de la solución se añade 18 g de NaCl disuelto en disolución en ~ 1800 ml de agua destilada con el ajuste de pH a 7.4 con la solución madre, seguido de dilución de 2 litros con agua destilada. Tripsina solución (0,05% de tripsina, el 0,1% CaCl 2) Contiene 0,1 g de tripsina y 0,2 g de CaCl2 en 200 ml de TBS (pH 7,8). Solución de sacarosa al 2,5% Contiene 5 g de sacarosa en 200 ml de TBS (pH 7,8). Solución madre de azida de sodio al 1% en TBS (pH 7,4) Contiene 1 g de Na-azida en 100 ml con TBS (pH 7,4). Dilución buffer: 0,1% de BSA, 0,01% de Na-azida (Se utiliza para diluir los anticuerpos en el kit Vectastain ABC). Contiene 0,1 g de albúmina sérica bovina (BSA) y 1 ml de 1% de Na-azida, se diluye hasta 100 ml con TBS (pH 7,4). ABC kit Vectastain PK 4002, ABC peroxidasa IgG de ratón Suero normal de caballo, suero de bloqueo; solución de color amarillo: 3 drops/10 tampón de dilución. Biotinilado anticuerpo anti-IgG de ratón, solución de azul: 1 drop/10 tampón de dilución. ABC-reactivos: solución de naranja, 2 gotas de solución de color marrón, más 2 ml drops/10 TBS (pH 7,4). Mezcla de estas soluciones 20 minutos antes de usar! Ratón (monoclonal) anti-rata endotelio (Biosource International, Camarillo, CA, EE.UU.) <table border="1"><tbody><tr><td> Catálogo # </td><td> ARU0181 </td></tr><tr><td> Clon # </td><td> MRC OX-43 </td></tr></tbody></table> Este anticuerpo está dirigido contra todas las células del endotelio vascular en la rata, con la excepción de aquellos en el cerebro. Vectastain peroxidasa avidina biotina (ABC) kit El kit contiene anticuerpos primaria, secundaria de anticuerpos con biotina, avidina-biotina complejo enzimático (ABC), y el sustrato de la enzima. Ver <a href="http://www.vectorlabs.com/">www.vectorlabs.com</a> o <a href="http://www.immunkemi.se/">www.immunkemi.se</a> para los protocolos. Albúmina de suero bovino (BSA) (Sigma-Aldrich, catálogo # A-4503). DAB = 3,3 &#39;-Diaminobencidina Isopac (Sigma-Aldrich, catálogo # D 9015). Tripsina de páncreas bovino (Sigma-Aldrich, catálogo # T 4665). Peroxidasa Vectastain ABC-kit, Mouse IgG (Immunkemi F &amp; D AB, Jarfalla, Suecia)

rat mesentery angiogenesis assay

El mesenterio rata adulta ventana de ensayo de la angiogénesis es biológicamente adecuado y está excepcionalmente bien adaptado para el estudio de brotes angiogénesis in vivo [ver artículos de revisión], que es la forma dominante de la angiogénesis en los tumores y tejidos humanos no tumorales, como se discutió en la revisión de invitados artículos 1,2. Angiogénesis inducida en las partes mesentérica membranosa por vía intraperitoneal (ip) la inyección de un factor pro-angiogénico puede ser modulada por vía subcutánea (sc), por vía intravenosa (iv) u oral (po) el tratamiento con agentes modificadores de la elección. Cada parte membranosa del mesenterio es transparente y enmarcado por el tejido adiposo, dándole una apariencia similar a la ventana. El ensayo tiene las características ventajosas siguientes: (i) el tejido vascularizado prueba de forma nativa, aunque poco, y ya que es muy delgada, la red de microvasos es prácticamente bidimensional, que permite a toda la red para ser evaluados microscópicamente in situ; ( ii) en ratas adultas del tejido prueba carece de la angiogénesis fisiológica importante, que caracteriza a la mayoría de los tejidos normales de los mamíferos adultos, el grado de vascularización materna es, sin embargo, en correlación con la edad, como se discutió en una, (iii) el nivel insignificante de la angiogénesis inducida por el trauma asegura una alta sensibilidad, (iv) el ensayo reproduce la situación clínica, como los medicamentos de prueba de la angiogénesis modulación se administran por vía sistémica y las respuestas observadas reflejan el efecto neto de todos los metabólicos, celulares y alteraciones moleculares inducidos por el tratamiento; (v) el ensayo permite la evaluación de los objetivos, las variables cuantitativas, sin prejuicios de la extensión espacial microvascular, la densidad y la formación de patrones de la red, así como de brotes capilares, lo que permite robusto análisis estadísticos de la relación dosis-efecto y molecular relaciones estructura-actividad, y (vi ) el ensayo pone de manifiesto con una alta sensibilidad a los efectos tóxicos o perjudiciales de los tratamientos en términos de disminución de la tasa fisiológica del peso corporal, como las ratas adultas creciendo sólidamente. Mastocitos mediada por la angiogénesis se demostró por primera vez utilizando este ensayo 3,4. El modelo muestra un alto nivel de discriminación respecto a los efectos de dosis-relaciones y los efectos medidos de la administración sistémica de química ni funcionalmente medicamentos estrechamente relacionados y las proteínas, incluyendo: (i) de baja dosis, administrada metronomically quimioterapéuticos estándares que producen diversos efectos específicos de drogas (es decir, las actividades de la angiogénesis-supresores, neutral o estimular la angiogénesis-5), (ii) naturales de hierro-insaturados lactoferrina humana, que estimula el VEGF-A la angiogénesis mediada por 6, y natural de hierro-insaturados lactoferrina bovina, lo que inhibe el VEGF-A- angiogénesis mediada por 7, y (iii) de bajo peso molecular fracciones de heparina producida por diversos medios 8,9. Por otra parte, el ensayo resulta muy adecuado para los estudios de los efectos combinados de la angiogénesis de los agentes que se administran por vía sistémica en forma simultánea o secuencial. La idea de hacer este video se originó a partir de finales de los años el doctor Judah Folkman, cuando visitó nuestro laboratorio y fue testigo de la metodología que se ha demostrado. Revisión de los documentos (invitado) discutir y evaluar el ensayo Norrby, K. En los modelos in vivo de la angiogénesis. J. Cell. Mol. Medicina 10, 588-612 (2006). Norrby, las pruebas con modelos K. Drogas angiogénesis. Opin experto. De drogas. Descubrimiento. 3, 533 a 549 (2008).

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Rat Mesentery Angiogenesis Assay

Adultos normales tejido vascularizado mamífero que carece de la angiogénesis fisiológica y que no ha sido expuesto a la intervención quirúrgica se utiliza para estudiar: (i) el inicio y desarrollo de la angiogénesis tras la administración intraperitoneal de agentes de prueba, y (ii) la modificación de la angiogénesis tras la administración sistémica de seleccionados agentes de pruebas.

Rata mesenterio ensayo angiogénesis

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in ...

Research

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13.8K vistas.  University of Gothenburg. Adultos normales tejido vascularizado mamífero que carece de la angiogénesis fisiológica y que no ha sido expuesto a la intervención quirúrgica se utiliza para estudiar: (i) el inicio y desarrollo de la angiogénesis tras la administración intraperitoneal de agentes de prueba, y (ii) la modificación de la angiogénesis tras la administración sistémica de seleccionados agentes de pruebas.

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Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis (Interview)

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro.  He explains the importance of fibroblasts that secrete a critical, yet unidentified, soluble factor that allow endothelial cells to form vessels in culture that branch, form proper lumens, and undergo anastamosis.

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis Interview

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro. He explains the importance of fibroblasts that secrete a critical, yet unidentified, soluble factor that allow endothelial cells to form vessels in culture that branch, form proper lumens, and undergo anastamosis.

Christopher Hughes: un modelo in vitro para el estudio de la angiogénesis (Entrevista)

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro.  He explains the importance of fibroblasts that ...

Investigación

Biología

Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, branching, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane.  Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels within the assays often do not resemble vessels in vivo.  Based on earlier work by Nehls and Drenckhahn, we have optimized an in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts.  This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis and, importantly, the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. EC are coated onto cytodex microcarriers and embedded into a fibrin gel.  Fibroblasts are layered on top of the gel where they provide necessary soluble factors that promote EC sprouting from the surface of the beads.  After several days, numerous vessels are present that can easily be observed under phase-contrast and time-lapse microscopy. This video demonstrates the key steps in setting up these cultures.

This video demonstrates the protocol of an in vitro angiogenesis assay that recapitulates several stages of angiogenesis. Time-lapse images of sprouting, lumen formation, branching and anastomosis - key features of angiogenesis - are shown.

Optimizado de gel de fibrina bolas de ensayo para el Estudio de la angiogénesis

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These ...

Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, organotypic slice cultures allow one to perform a number of manipulations that are not presently feasible in-vivo. To date, organtotypic embryonic brain slice cultures have been used to follow individual cells using time-lapse microscopy, manipulate the expression of genes in the ganglionic emanances (a region that is hard to target by in-utero electroporation), as well as for pharmacological studies. In this video protocol we demonstrate how to make organotypic slice cultures from rat embryonic day 18 embryos. The protocol involves dissecting the embryos, embedding them on ice in low melt agarose, slicing the embedded brains on the vibratome, and finally plating the slices onto filters in culture dishes. This protocol is also applicable in its present form to making organotypic slice cultures from different embryonic ages for both rats and mice. 

Cultura Cortar organotípicos de los cerebros de ratas E18

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, ...

Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in experimental models that range in scale from cell cultures to whole-organs[1, 2]. Using state-of-the-art optical imaging systems, generation and propagation of action potentials during normal cardiac rhythm or throughout initiation and maintenance of arrhythmias can be visualized almost instantly[1]. The latest commercially-available systems can provide information at exceedingly high spatiotemporal resolutions and were based on custom-built equipment initially developed to overcome the obstacles imposed by more conventional electrophysiological methods[1]. Advancements in high-resolution and high-speed complementary metal-oxide-semiconductor (CMOS) cameras and intensely-bright, light-emitting diodes (LEDs) as well as voltage-sensitive dyes, optics, and filters have begun to make electrical signal acquisition practical for cardiovascular cell biologists who are more accustomed to working with microscopes. Although the newest generation of CMOS cameras can acquire 10,000 frames per second on a 16,384 pixel array, depending on the type of sample preparation, long-established fluorescence acquisition technologies such as photodiode arrays, laser scanning systems, and cooled charged-coupled device (CCD) cameras still have some distinct advantages with respect to dynamic range, signal-to-noise ratio, and quantum efficiency[1, 3]. In the present study, Lewis rat hearts were perfused ex vivo with a crystalloid perfusate (Krebs-Henseleit solution) at 37&deg;C on a modified Langendorff apparatus. After a 20 minute stabilization period, the hearts were intermittently perfused with 11 mMol/L 2,3-butanedione monoxime to eliminate contraction-associated motion during image acquisition. For optical mapping, we loaded hearts with the fast-response potentiometric probe di-8-ANEPPS[4] (5 &mu;Mol/L) and briefly illuminated the preparation with 475&plusmn;15 nm excitation light. During a typical 2 second period of illumination, &gt;605 nm light emitted from the cardiac preparation was imaged with a high-speed CMOS camera connected to a horizontal macroscope. For this demonstration, hearts were paced at 300 beats per minute with a coaxial electrode connected to an isolated electrical stimulation unit. Simultaneous bipolar electrographic recordings were acquired and analyzed along with the voltage signals using readily-available software. In this manner, action potentials on the surface of Langendorff-perfused rat hearts can be visualized and registered with electrographic signals.

This article describes a high temporal and spatial resolution technique to optically image action potential movement on the surface of Langendorff-perfused rat hearts using a potentiometric dye (di-8-ANEPPS).

Mapeo óptico de corazones de ratas Langendorff perfundidos

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in ...

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research. Nevertheless, establishment of robust, viable cultured adult myocytes can be a technically challenging, rate-limiting step for many researchers. Here we described a protocol to obtain a high yield of adult rat heart myocytes that remain viable in culture for several days. The heart is isolated and perfused with collagenase and protease under low Ca2+ conditions to recover single myocytes. Ca2+-tolerant cells are obtained by stepwise increases in extracellular Ca2+ concentration in three subsequent wash steps. Cells are filtered, resuspended in culture medium, and plated on laminin coated slips. Cultured myocytes obtained using this protocol are viable for up to four days and are suitable for most experiments including electrophysiology, biochemistry, imaging and molecular biology.

In this paper, we described a typical way to isolate and culture adult rat heart myocytes. Collagenase and protease are used to digest and isolate single myocytes. Myocytes cultured follow this protocol meet most experiment requirements.

Cultivo primario de miocitos adultos de corazón de rata

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease conditions1, 2. Network growth is commonly attributed to angiogenesis, defined as the growth of new vessels from pre-existing vessels. The angiogenic process is also directly linked to arteriogenesis, defined as the capillary acquisition of a perivascular cell coating and vessel enlargement. Needless to say, angiogenesis is complex and involves multiple players at the cellular and molecular level3. Understanding how a microvascular network grows requires identifying the spatial and temporal dynamics along the hierarchy of a network over the time course of angiogenesis. This information is critical for the development of therapies aimed at manipulating vessel growth.
The exteriorization model described in this article represents a simple, reproducible model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. It was adapted from wound-healing models in the rat mesentery4-7, and is an alternative to stimulate angiogenesis in the mesentery via i.p. injections of pro-angiogenic agents8, 9. The exteriorization model is attractive because it requires minimal surgical intervention and produces dramatic, reproducible increases in capillary sprouts, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows for the two-dimensional visualization of entire microvascular networks down to single cell level. The stimulated growth reflects natural angiogenic responses in a physiological environment without interference of foreign angiogenic molecules. Using immunohistochemical labeling methods, this model has been proven extremely useful in identifying novel cellular events involved in angiogenesis. Investigators can readily correlate the angiogenic metrics during the time course of remodeling with time specific dynamics, such as cellular phenotypic changes or cellular interactions4, 5, 7, 10, 11.

This article describes a simple model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. The model produces dramatic increases in capillary sprouting, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows en face visualization of entire microvascular networks down to the single cell level.

Rata Exteriorización Mesenterio: un modelo para investigar la dinámica celulares implicados en la angiogénesis

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease ...

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using this protocol, angiogenesis may be measured in vitro in a fast, quantifiable manner. Primary or immortalized endothelial cells are mixed with conditioned media and plated on basement membrane matrix. The endothelial cells form capillary like structures in response to angiogenic signals found in conditioned media. The tube formation occurs quickly with endothelial cells beginning to align themselves within 1&#160;hr and lumen-containing tubules beginning to appear within 2 hr. Tubes can be visualized using a phase contrast inverted microscope, or the cells can be treated with calcein AM prior to the assay and tubes visualized through fluorescence or confocal microscopy. The number of branch sites/nodes, loops/meshes, or number or length of tubes formed can be easily quantified as a measure of in vitro angiogenesis. In summary, this assay can be used to identify genes and pathways that are involved in the promotion or inhibition of angiogenesis in a rapid, reproducible, and quantitative manner.

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

The tube formation assay is a fast, quantifiable method for measuring in vitro angiogenesis. Endothelial cells are combined with conditioned media and plated on basement membrane extract. Tube formation occurs within hours and newly formed tubules easily quantified.

Ensayo de formación de tubos de células endoteliales para la<em&gt; In Vitro</em&gt; Estudio de la angiogénesis

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular mechanisms regulating vascular permeability in cultured endothelial cell monolayers and the functional exchange properties of whole microvascular beds. A method to cannulate and perfuse venular microvessels of rat mesentery and measure the hydraulic conductivity of the microvessel wall is described. The main equipment needed includes an intravital microscope with a large modified stage that supports micromanipulators to position three different microtools: (1) a beveled glass micropipette to cannulate and perfuse the microvessel; (2) a glass micro-occluder to transiently block perfusion and enable measurement of transvascular water flow movement at a measured hydrostatic pressure, and (3) a blunt glass rod to stabilize the mesenteric tissue at the site of cannulation. The modified Landis micro-occlusion technique uses red cells suspended in the artificial perfusate as markers of transvascular fluid movement, and also enables repeated measurements of these flows as experimental conditions are changed and hydrostatic and colloid osmotic pressure difference across the microvessels are carefully controlled. Measurements of hydraulic conductivity first using a control perfusate, then after re-cannulation of the same microvessel with the test perfusates enable paired comparisons of the microvessel response under these well-controlled conditions. Attempts to extend the method to microvessels in the mesentery of mice with genetic modifications expected to modify vascular permeability were severely limited because of the absence of long straight and unbranched microvessels in the mouse mesentery, but the recent availability of the rats with similar genetic modifications using the CRISPR/Cas9 technology is expected to open new areas of investigation where the methods described herein can be applied.

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

Microperfusión Técnica de investigar Reglamento de Microvessel Permeabilidad en Rata Mesenterio

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents is important for protecting public health. The in vivo alkaline comet assay, which detects DNA damage as strand breaks, is especially relevant for assessing the genotoxic hazards of xenobiotics, as its responses reflect the in vivo absorption, tissue distribution, metabolism and excretion (ADME) of chemicals, as well as DNA repair process. Compared to other in vivo DNA damage assays, the assay is rapid, sensitive, visual and inexpensive, and, by converting oxidative DNA damage into strand breaks using specific repair enzymes, the assay can measure oxidative DNA damage in an efficient and relatively artifact-free manner. Measurement of DNA damage with the comet assay can be performed using both acute and subchronic toxicology study designs, and by integrating the comet assay with other toxicological assessments, the assay addresses animal welfare requirements by making maximum use of animal resources. Another major advantage of the assays is that they only require a small amount of cells, and the cells do not have to be derived from proliferating cell populations. The assays also can be performed with a variety of human samples obtained from clinically or occupationally exposed individuals.

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

The alkaline comet assay measures DNA strand breaks in eukaryotic cells. By adding an Endonuclease III or human 8-oxoguanine-DNA-N-glycosylase digestion step, the assay can efficiently detect oxidative DNA damage. We describe methods for using these assays to detect DNA damage in rat liver.

En Vivo alcalina Comet Assay y Comet Assay alcalina modificada con enzimas para la medición de roturas en el ADN Strand y daño oxidativo del ADN en el hígado de rata

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents ...

A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive expression of families of related receptors, a broad range of related ligands and the difficulty of dealing with primary cultures of specialized endothelial cells. Here we describe a bioassay for the detection of ligands to the vascular endothelial growth factor receptor-2 (VEGFR-2), a key transducer of signals that promote angiogenesis and lymphangiogenesis. A cDNA encoding a fusion of the extracellular (ligand-binding) region of VEGFR-2 with the transmembrane and cytoplasmic regions of the erythropoietin receptor (EpoR) is expressed in the factor-dependent cell line Ba/F3. This cell line grows in the presence of interleukin-3 (IL-3) and withdrawal of this factor results in death of the cells within 24 hr. Expression of the VEGFR-2/EpoR receptor fusion provides an alternative mechanism to promote survival and potentially proliferation of stably transfected Ba/F3 cells in the presence of a ligand capable of binding and cross-linking the extracellular portion of the fusion protein (i.e., one that can cross-link the VEGFR-2 extracellular region). The assay can be performed in two ways: a semi-quantitative approach in which small volumes of ligand and cells permit a rapid result in 24 hr, and a quantitative approach involving surrogate markers of a viable cell number. The assay is relatively easy to perform, is highly responsive to known VEGFR-2 ligands and can accommodate extracellular inhibitors of VEGFR-2 signaling such as monoclonal antibodies to the receptor or ligands, and soluble ligand traps.

We describe a simple cell-based bioassay for detecting, quantifying and monitoring the activity of members of the vascular endothelial growth factor family of ligands. The assay uses chimeric receptors expressed in a factor-dependent cell line to provide a semi-quantitative or quantitative assessment of receptor binding and cross-linking by the ligand.