Este método debe ser de interés para los investigadores que están tratando de aislar los complejos de proteínas de ARN e identificar su composición por espectrometría de masas. Creemos que nuestro protocolo será especialmente útil para purificar complejos que existen en células en cantidades limitadas y tienden a disociarse durante largos procedimientos de purificación de varios pasos. La principal ventaja de este método es que implica sólo un solo paso de purificación y podría ser utilizado con sitios de unión de ARN de cualquier longitud y secuencia.
Demostrar algunos de los pasos será Xiao-cui Yang, que es un técnico de investigación senior en nuestro grupo. Para sitios de unión significativamente más largos que 65 nucleótidos, obtenga ARN generado por T7 y un adaptador de oligonucleótido PCB como se describe en el protocolo de texto. Mezclar 20 picomoles del ARN con 100 picomoles del adaptador oligonucleótidos en un tubo de 1,5 mililitros que contenga 100 microlitros de tampón de unión.
Coloque el tubo en agua hirviendo y déjelo incubar durante 5 minutos. A continuación, deje que el agua se enfríe a temperatura ambiente. Primer suplemento 1 mililitro de extracto nuclear de ratón con EDTA de 80 milimolares a pH 8 a una concentración final de 10 milimolar.
A continuación, añada entre 5 y 10 picomoles del sustrato de ARN que ha sido etiquetado con la mitad de la placa CI. Incubar sobre hielo durante 5 minutos, asegurándose de mezclar ocasionalmente la muestra. A continuación, utilice una microcentrífuga preenfriada a 4 grados Celsius para centrifugar la mezcla a 10.000 veces g durante 10 minutos para eliminar cualquier precipitado potencial.
Recoger cuidadosamente el sobrenadante en un nuevo tubo en el hielo, mientras que tenga cuidado de evitar la transferencia del pellet. Transfiera aproximadamente 100 microlitros de suspensión de perlas de estreptavidina a un tubo de 1,5 mililitros. Agregue aproximadamente 1 mililitro de tampón de unión para comenzar a lavar las perlas.
Centrifugar el tubo a 25 veces g durante 2 a 3 minutos y aspirar el sobrenadante. Repita este proceso de lavado y centrifugación de 2 a 3 veces para equilibrar las perlas con el tampón de unión. Cargue el sobrenadante previamente recogido, que contiene el complejo ensamblado sobre las perlas equilibradas.
Con un rotador de tubo, gire el tubo durante 1 hora a 4 grados Celsius para inmovilizar el ARN y los complejos unidos en las perlas. A continuación, gire el tubo a 25 veces g durante 2 a 3 minutos para recoger las cuentas en la parte inferior del tubo. Aspirar al sobrenadante.
Y enjuague las perlas dos veces con tampón de unión, utilizando el proceso de lavado descrito anteriormente. Después de retirar el sobrenadante del segundo lavado, agregue 1 mililitro de tampón de unión y gire la muestra durante 1 hora a 4 grados centígrados. Gire hacia abajo la muestra a 25 veces g durante 2 a 3 minutos.
A continuación, agregue 1 mililitro de tampón de unión y transfiera la suspensión a un tubo nuevo. Gire la muestra a 4 grados centígrados durante un máximo de 1 hora. Centrifugar los complejos inmovilizados a 25 veces g durante 2 a 3 minutos.
A continuación, aspirar sobrenadante, y añadir 200 microlitros de búfer de unión. Transfiera las perlas a un tubo de 500 microlitros. Encienda una lámpara UV de alta intensidad que emita luz UV a 365 nanómetros y le permita alcanzar el brillo completo.
Llene la parte inferior de un plato de Petri con hielo apretado apilándolo sobre la tapa del plato. Vórtice brevemente el tubo que contiene los complejos inmovilizados. A continuación, colóquelo horizontalmente sobre el hielo y cúbralo con la lámpara precaleada, asegurándose de que la muestra esté de 2 a 3 centímetros de la superficie de la bombilla.
Irúnte la muestra durante un total de 30 minutos mientras se invierte y vórtice con frecuencia el tubo para garantizar una exposición uniforme y evitar el sobrecalentamiento. Después de esto, gire hacia abajo las cuentas a 25 veces g durante 2 a 3 minutos y recoger el sobrenadante. Centrifugar este sobrenadante una vez más utilizando las mismas condiciones.
Recoger el sobrenadante resultante asegurándose de dejar una pequeña cantidad en la parte inferior del tubo para evitar transferir cualquier perla residual. Usando la electroforesis SDS-PAGE, separe una fracción del sobrenadante uv eluado y la fracción correspondiente del material dejado en las perlas después de la elución UV. A continuación, utilice un kit de tinción de plata disponible comercialmente para manchar el gel.
Evaluar la eficiencia de la elución UV comparando las intensidades de las proteínas presentes en el sobrenadante eluido UV y las que quedan en las cuentas después de la irradiación UV. Exprime las bandas proteicas de interés y determina sus identidades por espectrometría de masas. Después de esto, analizar directamente una fracción del sobrenadante UV por espectrometría de masas para determinar todo el proteomo del material purificado de una manera imparcial.
En este estudio, el ARN del lazo del tallo etiquetado con biotina fotoescable se incuba con 1 mililitro de un extracto citoplasmático S100 obtenido a partir de células del mieloma ratones. Y el efecto y la eficiencia de la elución UV se analiza mediante la tinción de plata. Se detectan varias proteínas en las perlas de estreptavidina antes de la elución UV.
La irradiación con onda larga UV libera sólo algunas de estas proteínas en el sobrenadante dejando un fondo no específico en las cuentas. Esto enfatiza la importancia del paso de elución UV. La espectrometría de masas identifica las principales proteínas eluidas UV como 3'hExo y SLBP, con SLBP representada por la proteína de longitud completa y una serie de productos de degradación más cortos.
Pequeñas cantidades de otras proteínas identificadas como diversas proteínas de unión al ARN también liberadas selectivamente en solución por la irradiación UV. La elución UV de la histona inmovilizada de Drosophila pre-mRNA etiquetada con biotina fotoescable incubada con un extracto nuclear dio lugar a una liberación selectiva de sólo un pequeño número de proteínas en el sobrenadante con un fondo intenso de proteínas no específicas restantes en las cuentas. La espectrometría de masas identifica que estas proteínas son componentes del snRNP de U7.
No se detectan en presencia de competidores de procesamiento que bloquean la unión de U7 snRNP a histona pre-mRNA. Es importante utilizar la lámpara UV de alta intensidad y colocarla a una distancia cercana a la muestra irradiada, a la vez que se asegura de que no se sobrecaliente. El método de elución UV produce complejos nativos de proteínas de ARN que carecen de contaminantes importantes y son directamente adecuados para pasos de purificación adicionales y ensayos funcionales.
Evite la exposición a los ojos y a la piel durante la irradiación UV.
