Este protocolo inmunohistoquímico e histopatológico se puede utilizar para examinar el receptor de folato beta, que es una proteína candidata con potencial pronóstico y valor terapéutico para el microambiente vascular en la arteritis de células gigantes. Este protocolo es probado en el tiempo y ampliamente empleado y se puede utilizar para explorar los atributos beta del receptor de folato en los tejidos de las arterias temporales, incluso después de almacenamiento a largo plazo. Para adquirir secciones de tejido, utilice un microtoma para cortar secciones de cuatro a cinco micrómetros de espesor de las arterias temporales incrustadas en parafina, flotando cada sección en un baño de agua de 40 grados Celsius a medida que se obtienen, para eliminar las arrugas.
Utilice diapositivas de microscopio de vidrio para capturar tres secciones por diapositiva, y caliente las diapositivas en una placa de calentamiento, en un horno Celsius de 60 grados durante 60 minutos. Cuando las secciones se hayan adherido a los portaobjetos, coloque los portaobjetos en un bastidor vertical para secar a 37 grados centígrados durante 24 horas. Al día siguiente, transfiera las diapositivas a un contenedor de diapositivas para almacenarlos a cuatro grados centígrados durante al menos 12 horas.
A continuación, cargue diapositivas en un portaobjetos e hidrate los tejidos con dos inmersiones de cinco minutos, 100% de xileno y una serie de inmersión de etanol descendente de cinco minutos por concentración, con 10 segundos de agitación cada 30 segundos. Después de la inmersión del 70%etanol, enjuague los portaobjetos dos veces en agua doble destilada durante cinco minutos, con 10 segundos de agitación cada 30 segundos. Para la recuperación de antígenos, transfiera el bastidor a un recipiente de vidrio con 200 microlitros de 95 grados Celsius, 10 mililitros por litro de tampón de citrato durante 30 minutos.
Al final de la incubación, deje que los toboganes se enfríen a temperatura ambiente durante 20 minutos antes de enjuagar con agua corriente durante cinco minutos. Para eliminar la actividad peroxidasa endógena, utilice primero un marcador hidrófobo para dibujar un círculo alrededor de cada muestra de tejido, antes de incubar las muestras en 200 microlitros de 3%peróxido de hidrógeno durante 10 minutos, seguido de 3 lavados en 200 mifotes de solución salina tampón trised, o TBSS, por lavado. Después del último lavado, deslice suavemente cada diapositiva para eliminar cualquier exceso de tampón y agregue 200 microlitros del cóctel de anticuerpos primario de interés y un resbalón de cubierta a cada diapositiva para una incubación de una hora en una cámara húmeda a temperatura ambiente.
Al final de la incubación, deseche los resbalones de la cubierta y enjuague los portaobjetos con tres lavados de dos minutos en TBSS fresco. Después de eliminar el exceso de tampón, añada 200 microlitros de una solución adecuada de anticuerpos secundarios biotinilados y un resbalón de cobertura en cada portaobjetos para una incubación de 45 minutos en la cámara húmeda a temperatura ambiente. Después de desechar los resbalones de la cubierta, enjuague los portaobjetos con TBSS como se ha demostrado.
Elimine cualquier exceso de búfer. Y etiquete las secciones con 200 microlitros de tampón de sustrato DAB durante 10 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, lave los toboganes con TBSS y el agua corriente del grifo durante 10 minutos, antes de contramaner con hematoxilina durante tres minutos.
A continuación, agregue 70 microlitros de un medio de montaje adecuado a cada diapositiva y entor volce lentamente una tira de cubierta de vidrio en el medio de montaje para evitar la creación de burbujas a medida que el resbalón de la cubierta se baja en su lugar. Para el análisis histopatológico, coloque la diapositiva en la etapa de un microscopio de luz y evalúe la arquitectura vascular de la primera sección tisular. A continuación, cuantificar el número de macrófagos en relación con el número de linfocitos por sección.
Para el análisis inmunohistoquímico, examine el patrón de tinción beta del receptor de folato en cada sección del tejido y cuantifique el número de células beta positivas del receptor de folato, CD68 positivas y CD3 en 10 campos de alta potencia seleccionados aleatoriamente por sección. La tinción de hematoxilina y eosina en muestras normales revela una anatomía arterial normal, con células endoteliales en la tunica intima, células musculares lisas en los medios de la túnica, y una matriz de colágeno heterogénea, que incluye fibroblastos y vasos alimentadores llamados vasa vasorum en la tunica adventitia. Las arterias temporales positivas de células gigantes demuestran una inflamación moderada a grave, con agregados y macrófagos, o histiocitos, linfocitos, células plasmáticas ocasionales y células gigantes multinulciadas.
También se observa el estrechamiento luminoso, y acompañado de un engrosamiento notable y una interrupción del 90% de la lámina elástica interna. Los linfocitos positivos CD3 y los macrófagos positivos CD68 también están presentes en todos los especímenes positivos de arteritis de células gigantes, con patrones de tinción similares observados en todas las biopsias. La tinción para el receptor beta de folato se limita a los macrófagos y las células gigantes multinóspitas que se localizan preferentemente a la adventitia y a los medios de comunicación.
En particular, el receptor beta de folato comprendía aproximadamente el 30% del total de macrófagos. El procesamiento, corte y desescamiento de la biopsia de arteria temporal requiere una destreza cuidadosa para realizar los pasos posteriores. La interpretación de la diapositiva requiere la experiencia de un patólogo cardiovascular experimentado.
Recuerde a los espectadores que utilicen precauciones respiratorias y de contacto, como guantes y capuchas ventiladas, al manipular muestras y los reactivos.
