Este trabajo fue apoyado por el Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FWO) Vlaanderen G0466.10, 11I0113N; &quot;Eddy Merckx Beca de Investigación&quot; y el &quot;Sporta investigación Grant&quot; la cardiología pediátrica, UZ Lovaina, Bélgica (JC); el Centro de Molecular y Biología Vascular es apoyado por el Programmafinanciering KU Leuven (PF / 10/014), por el &quot;Geconcentreerde Onderzoeksacties&quot; (GOA 2009/13) por la Universidad de Lovaina y una beca de investigación de Boehringer Ingelheim.

Los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Ético de la Universidad Católica de Lovaina. 1. Las bacterias Preparación para In Vitro perfusiones e in vivo <ol><li> Se utilizó S. aureus cepa Newman para todos los experimentos descritos en este manuscrito. S. aureus Newman se almacenó en infusión cerebro corazón (BHI) con 10% de glicerol a -80 ° C. </li><li> Use un asa estéril para raspar las bacterias congeladas fuera e inocular en 5 ml de caldo de soja tríptico (TSB) O / N a 37 ° C (OD 600&gt; 3). </li><li> Lavar las bacterias por centrifugación (2600 g, RT, 5 min) y resuspender el sedimento bacteriano en 5 ml de PBS (tampón fosfato salino). </li><li> Preparar una solución de 1 mg / ml de 5 (6) éster de N-hidroxisuccinimidilo-carboxi fluoresceína (carboxi-fluoresceína) en etanol. Diluir el / solución de 1 mg ml carboxi-fluoresceína a 150 g / ml en agua de calidad de laboratorio (por ejemplo, agua MilliQ). Proteja los tubos de luzcon papel de aluminio y se almacena a -20 ° C. </li><li> Centrifugar las bacterias (2.600 xg, RT, 5 min). Resuspender el sedimento bacteriano en 800 l de PBS y añadir 200 l (concentración final de 30 mg / ml para los experimentos de perfusión) o 400 l (concentración final 50 mg / ml para los experimentos in vivo) de la / ml solución carboxi-fluoresceína 150 g. Proteja los tubos de la luz con papel de aluminio y se incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente en un agitador. </li><li> Después del marcaje, bloque con una solución de 6% de albúmina de suero bovino (BSA) en PBS. </li><li> Diluir bacterias usando densitometría óptica (DO), un OD 600 de 0,65 para los experimentos in vitro (correspondiente a aproximadamente 3 x 10 8 unidades formadoras de colonias (UFC) / ml para S. aureus) y un OD 600 de 1,8 para experimentos in vivo ( correspondiente a aproximadamente 1 x 10 9 UFC / ml para S. aureus) en PBS. Proteja los tubos de la luz con papel de aluminio y dejar en hielo. </li></ol> 2. Los experimentos in vitro de perfusión <ol><li> Recubrimiento de cubreobjetos de vidrio <ol><li> Diluir el factor de von Willebrand (VWF) (Haemate P, concentración de stock 2,400 g / ml) en agua de calidad de laboratorio (destilada desionizada) a una concentración final de 50 mg / ml. </li><li> Diluir colágeno en solución isotónica de glucosa (solución SKF, pH 2.7 a 2.9, tal como se suministra por el fabricante) a una concentración final de 160 mg / ml. </li><li> Escudo cubreobjetos de vidrio (24 × 50 mm) con VWF o colágeno dejando caer 200 l de la capa en Parafilm y colocar el cubreobjetos en la parte superior de la gotita. La gota se extenderá a lo largo de la superficie del cubreobjetos. </li><li> Incubar el cubreobjetos en un recipiente humidificado durante 4 horas a RT. Levante con cuidado el cubreobjetos de la parafina con una aguja roma. Montar el cubreobjetos en la parte inferior de la cámara de flujo. </li></ol></li><li> El recubrimiento de plástico desliza con células endoteliales <ol><li> Resbalones plástico Escudo(1-así ​​cámara de cultivo celular PCA, Sarstedt, Alemania) con 1 ml de una solución de gelatina al 1% en PBS e incubar durante 30 min a 37 ° C. Sembrar las células endoteliales de vena umbilical humanas (HUVEC) en las hojas de plástico recubiertos con gelatina y crecer a 70-80% de confluencia. Montar la hoja de plástico en la parte inferior de la cámara de flujo. </li></ol></li><li> Experimento de perfusión NOTA: Una visión esquemática del modelo in vitro de perfusión en está representado en la figura 1. <ol><li> Realizar estudios in vitro la adhesión bacteriana en una cámara de flujo placa de micro-paralelo a un esfuerzo de cizalla laminar entre 2,5 dinas / cm 2 y 20 dinas / cm 2 para simular diferentes condiciones de flujo fisiológicas. </li><li> El (diseño en-casa) cámara de flujo consiste en una estructura de metal y una cámara de perfusión hecha de plexiglás (poli (metil) metacrilato (PMMA)). Por lo conecta a una bomba de infusión de alta precisión (PHD 2000 Infusión, Harvard Apparatus, EE.UU.), podemos generar ra flujotes entre 0,0001 l / min y 220,82 ml / min. </li><li> Conectar el tubo a la parte superior de la cámara de flujo e inyectar medio en el tubo. Colocar suavemente la parte superior de la cámara de flujo en la parte superior de la parte inferior y montar la cámara de flujo. Tenga cuidado para evitar las burbujas de aire. Inyectar 1 ml de medio a través de la cámara para asegurarse de que la cámara no tenga fugas y para eliminar la solución de revestimiento en exceso. Evite las burbujas de aire. </li><li> Coloque el ratón sobre una almohadilla caliente termo-controlado a 37 ° C en una bandeja microscopio. Dado que este es un procedimiento de terminal, no hay necesidad de procedimientos asépticas estrictas. Hacer una incisión cerca de la vena yugular, eliminar suavemente el lado derecho del músculo cervical y aislar la vena yugular del tejido circundante. </li><li> Configure la bomba de infusión y el microscopio de fluorescencia. Ajustes de la bomba de infusión dependen del diámetro de la jeringa y el caudal deseado (ver sección 2.4). A partir de ahora, trabajar en un cuarto oscuro. </li><li> VWF Recubrimiento: <ol><li> Llene una jeringa con bacterias marcadas con fluorescencia y conectarlo al tubo de entrada. Evite las burbujas de aire. Encienda la bomba de infusión durante 10 minutos. El tiempo de infusión depende de la velocidad de cizallamiento y el recubrimiento, las bacterias y medio utilizado y debe representar el estado estacionario de la adhesión. </li><li> Después de 10 min, lavar las bacterias no unidas mediante la conexión de una jeringa con PBS al tubo de entrada y de arrancar la bomba de infusión. </li><li> Tomar por lo menos 15 imágenes o películas en diferentes lugares después del proceso de lavado. Las bacterias son pequeñas y potencialmente difícil de enfocar. Antes del experimento de flujo in vitro, el plano focal apropiada puede ser recuperada mediante la colocación de una gota de bacterias marcadas con fluorescencia en un cubreobjetos y colocar el cubreobjetos en la cámara de flujo. A continuación, busque el plano focal apropiado y guardar la configuración. NOTA: Durante el experimento de flujo in vitro, la captura de las imágenes durante la etapa de lavado (± 5 min después del inicio) asegura que sólo elseñal para las bacterias adherentes es capturado. </li></ol></li><li> Colágeno Recubrimiento: <ol><li> Añadir 60 g / ml VWF a las bacterias marcadas fluorescentemente justo antes de comenzar la perfusión. Llene una jeringa con bacterias marcadas con fluorescencia o bacterias marcadas fluorescentemente suplementado con 60 g / ml VWF y conectarlo al tubo de entrada. Evite las burbujas de aire. Repita los pasos 2.3.5.2 a 2.3.5.3 </li></ol></li><li> Células Endoteliales: <ol><li> Activar las células endoteliales por perfusión con una solución 0,1 mM del Ca 2+ -ionophore A23187 (solución madre 10 mM disueltos en dimetil sulfóxido (DMSO)) en DMEM a la misma velocidad de cizallamiento como la perfusión bacteriana durante 10 min por perfusión con una 0,1 mM. Repita los pasos 2.3.5.2 a 2.3.5.3. </li></ol></li></ol></li><li> Calcula la velocidad de cizallamiento y la tensión de cizallamiento de la siguiente manera. Velocidad de cizallamiento = 6Q / wh 2 Donde: Q: tasa en ml / min, flujo w: Ancho en cm, h: altura en cm Esfuerzo de corte (τ) = rata cizallaex viscosidad (μ) Donde μ: media: 0,01 dinas x seg / cm 2, la sangre total: 0,04 x seg dinas / cm 2 </li><li> Análisis de imagen <ol><li> Obtener imágenes en directo usando un microscopio de fluorescencia invertida con una cámara en blanco y negro y desarrollar el uso de software de imágenes. Utilice el tiempo de exposición de 1,5 seg. Tome varias instantáneas (al menos 15) distribuidas al azar sobre la superficie revestida de la cámara de flujo y guardarlos en el formato de archivo apropiado. </li><li> Realizar análisis de imágenes con ImageJ. Reste el fondo para eliminar fondos continuos suaves de la imagen (Proceso - Antecedentes Resta) y definir el umbral para establecer los valores de umbral inferior y superior, la segmentación de imágenes en escala de grises en las características de interés. Mida la zona limitada al umbral. </li><li> Comparar la adhesión bacteriana, expresado como área fluorescente, por ejemplo, usando software de análisis estadístico. Comparar los grupos usando ANOVA de una vía o two-cola prueba t de Student. Denuncie todos los valores como media ± error estándar de la media (SEM). Considere un valor de p &lt;0,05 significativo (* p &lt;0,05; ** p &lt;0,01; *** p &lt;0,001). </li></ol></li></ol> 3. En Vivo Modelo de perfusión mesentérica <ol><li> Preparación / cirugía del ratón <ol><li> Fast el ratón la noche antes del experimento con el fin de limitar el movimiento intestinal. </li><li> Dale un ratón viejo 6-8 semanas (C57BL / 6) analgesia preoperatoria mediante una inyección subcutánea de buprenorfina (0,1 mg / kg de peso corporal (PC)) 20 a 30 minutos antes de la cirugía. </li><li> Anestesiar el ratón por inyección intraperitoneal de ketamina (125 mg / kg de peso corporal) y xilazina (12,5 mg / kg de peso corporal). Compruebe por reflejo pedal. Aplique un ungüento veterinario para evitar la sequedad. </li><li> Coloque el ratón sobre una almohadilla caliente termo-controlado a 37 ° C en una bandeja microscopio. Dado que este es un procedimiento de terminal, no hay necesidad de una estricta asceptiprocedimientos c. Hacer una incisión cerca de la vena yugular, eliminar suavemente el lado derecho del músculo cervical y aislar la vena yugular del tejido circundante. </li><li> Insertar un catéter intravenoso francesa 2 en la vena yugular derecha para la infusión de bacterias marcadas fluorescentemente u otras soluciones. Abra la cavidad peritoneal a través de una incisión abdominal en la línea media y el uso de hisopos de algodón para difundir el mesenterio y para visualizar el arteriolas mesentéricas y circulación venular. </li><li> Coloque el ratón en el lado derecho en una placa transparente y asegurar la cánula con cinta adhesiva. Utilice una compresa caliente para evitar la hipotermia. Para prevenir la deshidratación del tejido, la caída de 500 l 0,9% de NaCl en los intestinos. </li></ol></li><li> Microscopía de fluorescencia de la adhesión bacteriana a la circulación mesentérica <ol><li> Trabajar en un cuarto oscuro. Use hisopos de algodón para inmovilizar los vasos y visualizarlos en un microscopio invertido. </li><li> Por vía tópica aplicar 5 l de una solución 10 mM of Ca 2+ -ionophore A23187 disolvió en DMSO. Después de 10 seg, inyectar 100 l bacterias marcadas (ver paso 1) a través del catéter yugular. Tomar imágenes con lapso de tiempo. Una vez finalizado el experimento, la eutanasia el ratón de acuerdo con las directrices aprobadas institucionales. </li></ol></li><li> Análisis De Imagen <ol><li> Obtener imágenes en directo utilizando un microscopio de fluorescencia invertida, capturaron con una cámara en blanco y negro y desarrollado utilizando cualquier software de imágenes. Aplicar tiempo de exposición automatizada y el contraste optimización específica para el equipo utilizado. </li><li> Adquirir imágenes con lapso de tiempo utilizando la herramienta de &#39;Adquisición&#39; en la barra de herramientas (Adquisiciones multidimensionales - Tiempo) usando 40 ciclos de 1.000 imágenes / seg. Guarde las imágenes en un formato de archivo de imagen correspondiente. </li><li> Imágenes de proceso utilizando el software de análisis ImageJ para medir el área de la señal fluorescente por imagen. Definir el umbral para establecer los valores de umbral inferior y superior, la segmentación de imágenes en escala de grises en fsticasoperativas de interés. Identificar la región de interés (vaso sanguíneo) y medir el área limitada al umbral y la región de interés. Comparar la adhesión bacteriana, expresado como el área de fluorescencia utilizando cualquier software estadístico o de gráficos. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Vanassche, T., Peetermans, W. E., Herregods, M. C., Herijgers, P., Verhamme, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-thrombotic+therapy+in+infective+endocarditis.">Anti-thrombotic therapy in infective endocarditis.</a> Expert Rev Cardiovasc Ther. 9 (9), 1203-1219 (2011).</li><li>Heying, R., van de Gevel, J., Que, Y. A., Moreillon, P., Beekhuizen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin-binding+proteins+and+clumping+factor+A+in+Staphylococcus+aureus+experimental+endocarditis:+FnBPA+is+sufficient+to+activate+human+endothelial+cells.">Fibronectin-binding proteins and clumping factor A in Staphylococcus aureus experimental endocarditis: FnBPA is sufficient to activate human endothelial cells.</a> Thromb Haemost. 97 (4), 617-626 (2007).</li><li>Pappelbaum, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultralarge+von+Willebrand+factor+fibers+mediate+luminal+Staphylococcus+aureus+adhesion+to+an+intact+endothelial+cell+layer+under+shear+stress.">Ultralarge von Willebrand factor fibers mediate luminal Staphylococcus aureus adhesion to an intact endothelial cell layer under shear stress.</a> Circulation. 128 (1), 50-59 (2013).</li><li>Claes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+of+Staphylococcus+aureus+to+the+vessel+wall+under+flow+is+mediated+by+von+Willebrand+factor&#8211;binding+protein.">Adhesion of Staphylococcus aureus to the vessel wall under flow is mediated by von Willebrand factor&#8211;binding protein.</a> Blood. 124 (10), 1669-1976 (2014).</li><li>Thiene, G., Basso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+and+pathogenesis+of+infective+endocarditis+in+native+heart+valves.">Pathology and pathogenesis of infective endocarditis in native heart valves.</a> Cardiovasc Pathol. 15 (5), 256-263 (2006).</li><li>Sixma, J. J., Schiphorst, M. E., Verweij, C. L., Pannekoek, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+deletion+of+the+A1+domain+of+von+Willebrand+factor+on+its+binding+to+heparin,+collagen+and+platelets+in+the+presence+of+ristocetin.">Effect of deletion of the A1 domain of von Willebrand factor on its binding to heparin, collagen and platelets in the presence of ristocetin.</a> Eur J Biochem/FEBS. 196 (2), 369-375 (1991).</li><li>Theilmeier, G., Lenaerts, T., Remacle, C., Collen, D., Vermylen, J., Hoylaerts, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+activated+platelets+assist+THP-1+monocytoid/endothelial+cell+interaction+under+shear+stress.">Circulating activated platelets assist THP-1 monocytoid/endothelial cell interaction under shear stress.</a> Blood. 94 (8), 2725-2734 (1999).</li><li>Bjerketorp, J., Jacobsson, K., Frykberg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+von+Willebrand+factor-binding+protein+(vWbp)+of+Staphylococcus+aureus+is+a+coagulase.">The von Willebrand factor-binding protein (vWbp) of Staphylococcus aureus is a coagulase.</a> FEMS Microbiol Lett. 234 (2), 309-314 (2004).</li><li>Friedrich, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylocoagulase+is+a+prototype+for+the+mechanism+of+cofactor-induced+zymogen+activation.">Staphylocoagulase is a prototype for the mechanism of cofactor-induced zymogen activation.</a> Nature. 425 (6957), 535-539 (2003).</li><li>Vanassche, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+formation+by+staphylothrombin+facilitates+Staphylococcus+aureus-induced+platelet+aggregation.">Fibrin formation by staphylothrombin facilitates Staphylococcus aureus-induced platelet aggregation.</a> Thromb Haemost. 107 (6), 1107-1121 (2012).</li><li>Vanassche, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+staphylothrombin-mediated+fibrin+deposition+in+catheter-related+Staphylococcus+aureus+infections.">The role of staphylothrombin-mediated fibrin deposition in catheter-related Staphylococcus aureus infections.</a> J Infect Dis. 208 (1), 92-100 (2013).</li><li>Buerkle, M. A., Lehrer, S., Sohn, H. Y., Conzen, P., Pohl, U., Kr&#246;tz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+inhibition+of+cyclooxygenase-2+enhances+platelet+adhesion+in+hamster+arterioles+in+vivo.">Selective inhibition of cyclooxygenase-2 enhances platelet adhesion in hamster arterioles in vivo.</a> Circulation. 110 (14), 2053-2059 (2004).</li><li>Kim, K. H., Barazia, A., Cho, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+heterotypic+platelet-neutrophil+interactions+on+the+activated+endothelium+during+vascular+inflammation+and+thrombus+formation+in+live+mice.">Real-time imaging of heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice.</a> J Vis Exp. 2 (74), (2013).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El esfuerzo cortante es un factor crucial para la pronta adhesión bacteriana a la pared del vaso y para la posterior generación de endovascular o vegetaciones endocárdicas e infecciones metastásicas 4,5. Hemos descrito complementario in vitro y en modelos in vivo para estudiar la patogénesis de las infecciones endovasculares bajo estrés de cizalla fisiológica. Estos modelos han permitido identificar la proteína de unión del factor de von Willebrand (vWbp) como el principal S. proteína aureus para interactuar bajo flujo con una pared vascular lesionada exponer VWF 4. Infecciones endovasculares y la endocarditis infecciosa, en particular, son motivo de preocupación no sólo por la insuficiencia orgánica inducida por sepsis y muerte, pero también a causa de (&#39;&#39;) metastásicos complicaciones locales y distantes. Para provocar endocarditis infecciosa e infecciones metastásicas, las bacterias tienen que adherirse a la pared del vaso y por lo tanto resistir el esfuerzo cortante de la sangre que fluye. Másestudios sobre bacterias factores de virulencia se han realizado en condiciones estáticas. Sin embargo, estas interacciones establecidas no pueden soportar las fuerzas de corte y estudios en condiciones de flujo puede revelar nuevos factores, no reconocidos previamente en la interacción bacteria-huésped. El uso de la cámara de flujo micro-paralelo, nosotros y otros han demostrado la importancia de FVW de adhesión vascular. Bajo esfuerzo de corte, FVW progresivamente se despliega a partir de su estructura globular de descanso, y expone el dominio A1 que interactúa con las plaquetas a través de su receptor GPIb 6. Cámaras de flujo se han utilizado ampliamente para estudiar la función plaquetaria 7. Sorprendentemente, también S. aureus adherencia bajo flujo requiere VWF, y en particular el dominio A1 que se expone a cizallamiento. Identificamos vWbp para mediar FVW vinculante. vWbp es un coagulasa que contribuye a S. aureus fisiopatología mediante la activación de la protrombina del anfitrión. Staphylothrombin, la resulting complejo de un coagulasa bacteriana y protrombina, convierte el fibrinógeno en fibrina insoluble 8,9. Nuestros estudios han demostrado que vWbp no sólo activar la protrombina, pero desencadena la formación de agregados de bacterias de fibrina-plaquetas, que mejoran la adherencia a los vasos sanguíneos bajo flujo de 4,10,11. El modelo de cámara de flujo in vitro permite estudiar los diferentes actores de la adhesión bacteriana a componentes celulares o matriz. Factores de virulencia bacterianos pueden ser estudiados utilizando mutantes o bacterias inocuas que expresan proteínas de superficie específicas. Alternativamente, los inhibidores farmacológicos o anticuerpos bloqueantes pueden añadirse al medio en la cámara de flujo. El papel de los factores del huésped tales como diferentes constituyentes de la matriz extracelular se puede estudiar mediante el uso de cubreobjetos con diferentes recubrimientos. Los cubreobjetos también pueden ser cubiertos con células endoteliales, de los cuales el estado de activación puede modularse mediante la adición de estimuladores específicos. Apart de la pared vascular, la contribución de las células de la sangre de acogida y las proteínas plasmáticas puede ser estudiada mediante la adición de estos factores al medio que fluye. Por lo tanto, diferentes condiciones de creciente complejidad se pueden estudiar en condiciones estandarizadas de flujo laminar para desentrañar las interacciones que permiten que las bacterias se adhieran a la pared del vaso in vivo. Interacciones identificadas en el modelo in vitro se estudian posteriormente en un modelo animal para probar su relevancia en un organismo complejo. Otros modelos in vivo para estudiar las interacciones dinámicas bajo flujo han sido descritos, tales como la cámara de pliegue cutáneo dorsal de hámster 12 y el modelo 13 cremáster. En comparación, el modelo de perfusión mesentérica descrito aquí ofrece varias ventajas debido a su facilidad de uso, la posibilidad de variar el anfitrión de antecedentes genéticos de los ratones y para evaluar las intervenciones farmacológicas. En conclusión, los modelos descritosofrecer la posibilidad de estudiar las proteínas de superficie no sólo de S. aureus, sino de muchos otros microorganismos en los diferentes orígenes de acogida, para comprender mejor la patogénesis de las infecciones vasculares.

To establish endovascular infections, pathogens require a mechanism to adhere to the endothelium, which lines the vessel wall and the inner surface of the heart, and to persist and establish an infection despite being exposed to the shear stress of rapidly flowing blood. The most frequent pathogen causing life-threatening endovascular infections and infective endocarditis is Staphylococcus aureus (S. aureus)1. 
Various bacterial surface-bound adhesive molecules mediate adhesion to host tissue by interacting with extracellular matrix components. These MSCRAMMs (microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules) recognize molecules such as fibronectin, fibrinogen, collagen and von Willebrand factor (VWF). MSCRAMMs are important virulence factors of S. aureus and are implicated in the colonization and invasion of the host2. Most studies on these virulence factors have been performed in static conditions, and thus may not be representative for human infections where initial adhesion of the bacteria occurs in flowing blood. 
In the case of bloodstream infections, bacteria need to overcome the shearing forces of flowing blood in order to attach to the vessel wall. Models that investigate the interaction between bacteria and endothelium or subendothelium under flow conditions are therefore of particular interest. 
A recent study showed that the adhesion of S. aureus to blood vessels under shear stress is mediated by VWF3. VWF, a shear stress-operational protein, is released from endothelial cells upon activation. Circulating VWF binds to collagen fibers of the exposed subendothelial matrix. Our group reported that the von Willebrand factor-binding protein (vWbp) of S. aureus is crucial for shear-mediated adhesion to VWF4. 
In this article, we present an in vitro flow chamber model where bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells can be evaluated. To validate the findings from in vitro data, we have developed an in vivo model that visualizes and quantifies the direct interaction of bacteria with the vessel wall and the formation of bacteria-platelet thrombi in the mesenteric circulation of mice, using real-time intravital vascular microscopy.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="border-collapse:
 collapse;width:192pt">
	<colgroup>
		<col span="4" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Brain Heart Infusion (BHI)</td>
			<td>BD Plastipak&#160;</td>
			<td align="right">237500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth (TSB)</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>CM0129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190-169</td>
			<td>D-PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5(6)-carboxy-fluorescein N-hydroxysuccinimidyl ester&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>21878-25MG-F</td>
			<td>fluorescent labeling&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA)</td>
			<td>Roch</td>
			<td colspan="2">10 735 086 001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haemate-P</td>
			<td>CSL Behring</td>
			<td>PL 15036/0010</td>
			<td>VWF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horm collagen</td>
			<td>Takeda</td>
			<td align="right">10500</td>
			<td>collagen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-well PCA cell culture chambers</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td align="center" class="xl63">########</td>
			<td>plastic slips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temgesic</td>
			<td>Reckitt Benckiser</td>
			<td align="right">283716</td>
			<td>bruprenorphine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesketin (Ketamin hydrochloride 115 mg/ml (100 mg/ml ketaminum))</td>
			<td>Eurovet</td>
			<td>BE-V136516</td>
			<td>ketamin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYL-M 2% (xylazine hydrochloride 23.32 mg/ml (20 mg/ml xylazine))</td>
			<td>VMD Arendonk</td>
			<td>BE-V170581</td>
			<td>xylazine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 french intravenous catheter green</td>
			<td>Portex</td>
			<td colspan="2">200/300/010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,9% Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Baxter Healthcare</td>
			<td>W7124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cotton swabs</td>
			<td>International Medical Product</td>
			<td align="right">300230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca2+-ionophore solution A23187</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td colspan="2">C7522-10 MG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26 gauge 1 ml syringe&#160;&#160;</td>
			<td>BD Plastipak&#160;</td>
			<td align="right">300013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26 gauge 1 ml syringe&#160; with needle</td>
			<td>BD Plastipak&#160;</td>
			<td align="right">300015</td>
			<td>intra-peritoneal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810-R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td colspan="2">5811 000.320</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slips (24x50)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BB02405A11</td>
			<td>Thickness No, 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHD 2000 Infusion</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td align="right">702100</td>
			<td>High-accuracy Harvard infusion pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio-observer DI</td>
			<td colspan="2">Carl-Zeiss</td>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td colspan="2">National Institute of Health</td>
			<td>Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 5,0</td>
			<td colspan="2">Graphpad Software</td>
			<td>Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioCam MRm</td>
			<td colspan="2">Carl-Zeiss&#160;</td>
			<td>Black and white camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro and in vivo model to study bacterial adhesion to the vessel wall under flow conditions

Con el fin de causar infecciones endovasculares y endocarditis infecciosa, las bacterias deben ser capaces de adherirse a la pared del vaso mientras se expone a la tensión de cizallamiento de la sangre que fluye. Para identificar los factores bacterianos y de acogida que contribuyen a la adhesión vascular de los microorganismos, se necesitan modelos apropiados que estudian estas interacciones en condiciones de cizallamiento fisiológicas. Aquí, se describe un modelo in vitro de cámara en flujo que permite investigar la adhesión bacteriana a diferentes componentes de la matriz extracelular o a las células endoteliales, y un modelo de microscopía intravital que fue desarrollado para visualizar directamente la adherencia inicial de las bacterias a la circulación esplácnica in vivo . Estos métodos pueden ser utilizados para identificar los factores bacterianos y del huésped requeridos para la adherencia de las bacterias bajo flujo. Ilustramos la relevancia de la tensión de cizallamiento y el papel del factor von Willebrand para la adhesión de Staphylococcus aureus utilizando tanto el modelo in vitro y in vivo.

S. aureus adhesión a FVW, la matriz subendotelial y las células endoteliales es un fenómeno dependiente de la tensión de cizallamiento Para enfatizar el papel del esfuerzo cortante en la interacción entre S. aureus y VWF, que realizaron perfusiones más de FVW cubreobjetos recubiertos a diferentes velocidades de corte (una visión esquemática del modelo in vitro de perfusión en se da en la figura 1. La adhesión de S. aureus a FVW incrementa con velocidades de cizalla crecientes de 250 seg -1 a 2000 sec -1 (Figura 2), lo que indica que las fuerzas de alto cizallamiento no inhiben pero refuerzan la adhesión de las bacterias a VWF. Con el fin de investigar la contribución de VWF a la adhesión bacteriana a colágeno, el componente principal de la matriz subendotelial, que perfundidos marcado con fluorescencia S. aureus sobre colágeno en presencia o ausencia de VWF. En ausencia de VWF, la adhesión de S. laureus al colágeno disminuye con el aumento de velocidades de cizallamiento. Sin embargo, cuando VWF estaba presente en el medio, la adherencia de S. aureus aumentó con el aumento de las tasas de corte (Figura 3). El modelo de flujo in vitro también nos permite examinar la adhesión de las bacterias a las células endoteliales bajo flujo. Nos perfundidos HUVECs con fluorescencia etiquetados S. aureus a velocidades de cizallamiento de 500 a 2000 seg -1. Donde se indique, HUVECs se activa con un Ca 2+ -ionophore, para provocar la liberación de FVW. La activación de células endoteliales y la posterior liberación VWF, aumento de la adhesión de S. aureus (Figura 4A), que se formó patrones típicos &quot;-cadena como&quot; de marcado con fluorescencia agrupaciones bacterianas alineados en la dirección de la fuerza de corte (Figura 4B), lo que sugiere la unión de bacterias a lo largo de una molécula lineal VWF-estirado. Inicial in vivola adhesión bacteriana en las venas esplácnico está mediada por VWF Desde S. aureus es capaz de adherirse a VWF, hemos utilizado ratones de tipo salvaje (vWF + / +) y VWF-ratones deficientes (vWF - / -) para investigar la adhesión bacteriana a la pared del vaso activado in vivo. Videomicroscopia en tiempo real de las venas esplácnicos permitió la visualización in vivo de la circulación de la etiqueta fluorescente S. aureus (visión general esquemática del modelo de perfusión en vivo se representa en la figura 5). Después de la activación farmacológica del endotelio por el Ca 2+ -ionophore, se observó una rápida acumulación local de las bacterias y los agregados de bacterias individuales a la pared del vaso de ratones WT (Videos suplementario 1 y 2). Se observó casi ninguna adherencia de bacterias en la pared del vaso activada de vWF -deficieratones nt (suplementario Video 3) en comparación con la adhesión en ratones WT (Figura 6). La ausencia de VWF disminuye la capacidad de S. aureus de adherirse a la pared del vaso activado. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig1.jpg" /> Figura 1. Una representación esquemática del modelo de flujo in vitro. El modelo de flujo in vitro es un modelo multifuncional, que permite el estudio de diferentes mecanismos dependientes de cizallamiento tales como la adhesión bacteriana a la matriz subendotelial, sino también la formación de trombos. La cámara de flujo micro-paralelo se coloca sobre un cubreobjetos (de plástico o vidrio) con diferentes recubrimientos de proteínas y células endoteliales. La adhesión de bacterias diferentes (naranja y puntos grises) puede ser analizada, y el impacto de la presencia de las proteínas del plasma, plaquetas y sangre entera puede ser evaluada. Marcadores fluorescentes para plaquetas (óvalos azules) o fibrinogen cadenas (azul) se puede utilizar en combinación con diferentes inhibidores (óvalos negros) para distinguir factores bacterianos y del huésped. Imágenes representativas de la adhesión bacteriana de S. aureus al recubrimiento de colágeno en presencia (inferior) o ausencia (superior) del FVW se muestra (barra de escala es de 100 micras). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/52862fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig2.jpg" /> Figura 2. La adhesión de S. aureus a los aumentos de FVW con el aumento de velocidades de cizallamiento. Micro-paralelo perfusión cámara de flujo sobre revestido VWF (50 g / ml) con marcado con fluorescencia S. aureus Newman a velocidades de cizallamiento de 250 a 2000 s-1 (s-1) en el medio (n&gt; 5). Todos los resultados se expresan como media ± SEM. * P &lt;0,05, ** p &lt;0,01. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig3.jpg" /> Figura 3. La adhesión de S. aureus a subendotelio es cizallamiento y VWF dependiente. Micro-paralelo perfusión cámara de flujo sobre colágeno recubierto (160 g / ml) con la etiqueta fluorescente S. aureus Newman a velocidades de cizallamiento de 250 a 2000 seg -1 en medio (n&gt; 5). VWF (60 g / ml) estaba presente en el medio donde se indica. Todos los resultados se expresan como media ± SEM. ** P &lt;0,01. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig4.jpg" /> Figura 4. La adhesión de S. aureus a las células endoteliales activadas es cizalla dependiente. perfusión cámara de flujo-Micro paralelo sobre las células endoteliales. (A) las células endoteliales de la vena umbilical humana se activaron con el Ca 2+ -ionophore A23.187 (0,1 mM) seguido de una perfusión de 10 min marcado con fluorescencia S. aureus Newman a velocidades de cizallamiento de 500 a 2000 seg -1 en medio (n&gt; 5). Todos los resultados se expresan como media ± SEM. * P &lt;0,05. (B) Imagen de la micro-cámara de flujo paralelo de perfusión durante HUVECs activadas con S. aureus a una velocidad de cizallamiento de 1000 seg -2. S. aureus forma cadenas de ± 200 micras de longitud, lo que sugiere la adhesión a multímeros de FVW (barra de escala es de 100 micras). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/52862fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig5.jpg" /> Figura 5. Una visión esquemática del modelo de perfusión mesentérica in vivo. Un catéter en la vena yugular derecha (línea amarilla) está insertada para la administración de fluorbacterias escently marcados (puntos de color naranja), anestésicos adicionales u otros componentes tales como inhibidores farmacéuticos y anticuerpos. La cavidad peritoneal se abre y el mesenterio se extiende para visualizar los vasos sanguíneos (venosos y arteriales) bajo un microscopio de fluorescencia. Después de la activación farmacológica del endotelio por un -ionophore Ca 2+, que induce la liberación de FVW, las bacterias pueden ser inyectados a través del catéter de la vena yugular. Microscopía de vídeo intravascular en tiempo real permite la visualización en vivo de bacterias circulantes marcados con fluorescencia y la formación resultante de bacterias en plaquetas trombos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/52862fig5large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig6.jpg" /> Figura 6. La adhesión inicial de S. aureusal endotelio activado in vivo está mediada por FVW En vivo venosa modelo perfusión mesentérica con C57BL / 6-FVW + / + y C57BL / 6-vWF -. / - ratones. La adhesión de la etiqueta fluorescente S. aureus a la pared del vaso localmente activado es significativamente menor en vWF - / - ratones. Todos los resultados se expresan como media ± SEM. *** P &lt;0.001, n&gt; 7. <img alt="Vídeo Figura 1" src="/files/ftp_upload/52862/52862figV1.jpg" /> Video 1: adherencia en tiempo real de S. aureus a la pared del vaso activado en FVW + / + ratones. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/Video1JorienClaes.mov" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver el vídeo.</a> Video 2: formación de agregados en tiempo real y la embolización de S. aureus en FVW ratones + / +. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/Video2JorienClaes.mov" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver el vídeo.</a> <img alt="Vídeo Figura 3" src="/files/ftp_upload/52862/52862figV3.jpg" /> Video 3: adherencia en tiempo real de S. aureus a la pared del vaso activado en FVW - / -. ratones in vivo modelo de perfusión mesentérica con FVW + / + y vWF - / - ratones. Cinco l de una -ionophore Ca 2+ (10 mM) se aplied a la región de la cama vascular visualizado. Una suspensión de la etiqueta-carboxi-fluoresceína S. aureus se inyectó a través del catéter yugular. La circulación mesentérica se visualizó bajo un microscopio invertido. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/Video3JorienClaes.mov" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver el vídeo.</a>

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In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

In vitro e in vivo modelo para estudiar la adhesión bacteriana a la pared del recipiente en condiciones de flujo

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

10.5K vistas.  KU Leuven. To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion. 

Video: In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host cells1. These adhesins rely on interactions with host cell surface receptors or soluble proteins acting as a bridge between bacteria and host. Adhesion is a critical first step prior to invasion and/or secretion of toxins, thus it is a key event to be studied in bacterial pathogenesis. Furthermore, adhered bacteria often induce exquisitely fine-tuned cellular responses, the studies of which have given birth to the field of 'cellular microbiology'2. Robust assays for bacterial adhesion on host cells and their invasion therefore play key roles in bacterial pathogenesis studies and have long been used in many pioneer laboratories3,4. These assays are now practiced by most laboratories working on bacterial pathogenesis.
Here, we describe a standard adherence assay illustrating the contribution of a specific adhesin. We use the Escherichia coli strain 27875, a human pathogenic strain expressing the autotransporter Adhesin Involved in Diffuse Adherence (AIDA). As a control, we use a mutant strain lacking the aidA gene, 2787&Delta;aidA (F. Berthiaume and M. Mourez, unpublished), and a commercial laboratory strain of E. coli, C600 (New England Biolabs). The bacteria are left to adhere to the cells from the commonly used HEp-2 human epithelial cell line. This assay has been less extensively described before6.

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

This protocol is a simple bacterial adhesion assay consisting in counting the numbers of bacterial colony forming units that are adhered onto cultured cells. The assay is robust, independent of the adhesin studied, and numerous variations are used in most laboratories working on bacterial pathogenesis.

Ensayo in vitro de la adhesión bacteriana a las células epiteliales de mamíferos

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Investigación

Inmunología e Infección

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

La introducción de la tensión de cizallamiento en el Estudio de la adhesión bacteriana

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

Uso de un medio artificial de esputo para probar la eficacia de antibióticos contra la<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; En condiciones más pertinentes a la fibrosis quística pulmonar

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

Aislamiento de células endoteliales de vena umbilical y su uso en el Estudio de la transmigración de neutrófilos bajo condiciones de flujo

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo para estudiar la heterogeneidad de diferenciación de los macrófagos humanos y polarización

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

Cuantitativo<em&gt; In vitro</em&gt; Ensayo para medir la adhesión de neutrófilos al Activado Primaria células endoteliales microvasculares humanas en condiciones estáticas

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood vessels resulting in vascular leak, the development of purpuric rashes and eventual tissue necrosis. Studying the pathogenesis of this infection was previously limited by the human specificity of the bacteria, which makes in vivo models difficult. In this protocol, we describe a humanized model for this infection in which human skin, containing dermal microvessels, is grafted onto immunocompromised mice. These vessels anastomose with the mouse circulation while maintaining their human characteristics. Once introduced into this model, N. meningitidis adhere exclusively to the human vessels, resulting in extensive vascular damage, inflammation and in some cases the development of purpuric rash. This protocol describes the grafting, infection and evaluation steps of this model in the context of N. meningitidis infection. The technique may be applied to numerous human specific pathogens that infect the blood stream.

Neisseria meningitidis is a human specific pathogen that infects blood vessels. In this protocol human microvessels are introduced into a mouse by grafting human skin onto immunocompromised mice. Bacteria adhere extensively to the human vessels, leading to vascular damage and development of the purpuric rash typically observed in human cases.

Humanizado modelo de ratón para el Estudio de Infecciones Bacterianas Targeting la microvasculatura

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

Un ensayo de adhesión de flujo para estudiar Leucocyte Reclutamiento para hepático humano sinusoidales endotelio en condiciones de estrés de cizalla

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and interaction with antigen presenting cells (APC) in the formation of immunological synapses. These two contexts of T cell adhesion differ in that T cell-APC interactions can be considered static, while T cell-blood vessel interactions are challenged by the shear stress generated by circulation itself. T cell-APC interactions are classified as static in that the two cellular partners are static relative to each other. Usually, this interaction occurs within the lymph nodes. As a T cell interacts with the blood vessel wall, the cells arrest and must resist the generated shear stress.1,2 These differences highlight the need to better understand static adhesion and adhesion under flow conditions as two distinct regulatory processes. The regulation of T cell adhesion can be most succinctly described as controlling the affinity state of integrin molecules expressed on the cell surface, and thereby regulating the interaction of integrins with the adhesion molecule ligands expressed on the surface of the interacting cell. Our current understanding of the regulation of integrin affinity states comes from often simplistic in vitro model systems. The assay of adhesion using flow conditions described here allows for the visualization and accurate quantification of T cell-epithelial cell interactions in real time following a stimulus. An adhesion under flow assay can be applied to studies of adhesion signaling within T cells following treatment with inhibitory or stimulatory substances. Additionally, this assay can be expanded beyond T cell signaling to any adhesive leukocyte population and any integrin-adhesion molecule pair.

This flow adhesion assay provides a simple, high impact model of T cell-epithelial cell interactions. A syringe pump is used to generate shear stress, and confocal microscopy captures images for quantification. The goal of these studies is to effectively quantify T cell adhesion using flow conditions.

Ensayo de adhesión en condiciones de estrés de cizalla para el Estudio de linfocitos T-molécula de adhesión Interacciones

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin acquisition at the bacterial cell surface plays in resistance to the host immune system. Flow cytometry experiments identified human plasma vitronectin as a ligand for the bacterial receptor outer membrane protein H of Haemophilus influenzae type f. An enzyme-linked immunosorbent assay was employed to characterize the protein-protein interactions between purified recombinant protein H and vitronectin, and binding affinity was assessed using bio-layer interferometry. The biological importance of the binding of vitronectin to protein H at the bacterial cell surface in evasion of the host immune response was confirmed using a serum resistance assay with normal and vitronectin-depleted human serum. The importance of vitronectin in bacterial adherence was analyzed using glass slides with and without vitronectin coating, followed by Gram staining. Finally, bacterial adhesion to human alveolar epithelial cell monolayers was investigated. The protocols described here can be easily adapted to the study of any bacterial species of interest.

This report describes protocols for characterizing interactions between bacterial outer membrane proteins and the human complement regulator vitronectin. The protocols can be used to study the binding reactions and biological function of vitronectin in any bacterial species.

Ensayos para estudiar el rol de vitronectina en la adhesión bacteriana y resistencia de suero

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...