Este protocolo nos permitió resolver la estructura de TRPC3 humano, un miembro de una familia importante, pero poco estudiada de canales iónicos. La principal ventaja de esta técnica es la alta eficiencia con la que se puede aplicar para expresar y purificar una variedad de proteínas, tanto para estudios estructurales como funcionales. Este método puede proporcionar un sistema eficiente de expresión y purificación de proteínas, para el estudio de la bioquímica de proteínas y la biofísica y se puede aplicar a una amplia variedad de canales iónicos y otras proteínas de membrana.
En primer lugar, compruebe la expresión relativa del virus viendo la fluorescencia GFP del virus en una muestra del cultivo productor de virus. En un matraz de cultivo Erlenmeyer de fondo desconcertado de tamaño suficiente, preparar un volumen deseable de un cultivo de suspensión celular de mamífero HEK293, a una concentración de 3,5 a 3,8 millones de células por mililitro en el medio de expresión, complementado con 1% de FBS estéril. Añadir un 8% en volumen de solución de stock de virus P2 preparada e incubar en un agitador orbital a 37 grados centígrados y 135 RPM.
A las 12 a 18 horas después de la infección añadir 10 butirato de sodio milimolar, incubar a 30 grados Celsius durante la cantidad de tiempo necesario para una expresión óptima de la proteína. Después de esto, centrifugar a 2.880 veces la gravedad durante 20 minutos para cosechar las células. Lavar y resuspender las células en aproximadamente 100 mililitros de TBS por litro de células cosechadas.
Centrifugar de nuevo a 2.880 veces la gravedad durante 20 minutos y recoger el pellet celular. También recoger pequeñas cosechas de pellets de células de un mililitro en diferentes puntos de tiempo y solubilizar durante dos horas a cuatro grados Celsius con agitación en presencia de diferentes detergentes y / o aditivos. Aclare estas pequeñas muestras solubilizadas de células enteras por ultracentrifugación a 235.000 veces la gravedad y a cuatro grados centígrados durante 10 minutos.
A continuación, ejecútelas como muestras de 30 microlitrotros en una columna de cromatografía SEC, para determinar el mejor momento para la expresión y las mejores condiciones de solubilización. Descongelar el pellet en 100 mililitros de tampón por litro de células cosechadas. Una vez descongeladas las células, pipetee o revuelva para asegurarse de que la solución sea homogénea.
Deje que las células se solubilicen a cuatro grados centígrados en un vaso de precipitados sumergido en hielo durante dos horas mientras se agita por una barra de agitación. A continuación, retire los desechos celulares por ultracentrifugación a 235.000 veces la gravedad y a cuatro grados centígrados durante una hora. Ejecute una muestra de 30 microlitros del sobrenadante en una columna SCC de HPLC para verificar la cantidad de proteína y visualizar la proteína diana por salida de señal GFB.
Aplicar el sobrenadante unido a resina de afinidad de cobalto que contiene la proteína solubilizada a una columna de gravedad y recoger el flujo a través. Ejecute una muestra de 30 microlitrotros del flujo a través en una columna SCC para verificar que la proteína se une a la resina. A continuación, lave la resina con volúmenes de 10 columnas de tampón.
Ejecute una muestra de 30 microlitros del lavado en una columna SCC para comprobar si hay pérdida de proteína. Usando tampón, eluda el TRPC3 humano unido a la resina. Ejecute una muestra de 90 microlitros del eluyente que se ha diluido de uno a 100 en una columna SSC para comprobar que la proteína ha sido eluida y verificar la presencia de una señal GFP en la posición correspondiente al tamaño de la proteína objetivo.
Añadir trombina en una proporción de uno a 20 molares y añadir 10 mililitros de EDTA a la muestra eluida. Incubar a cuatro grados centígrados durante tres horas. Después de esto, transfiera el eluant a un tubo de filtro centrífugo de 15 mililitros.
Gire el tubo a 2.800 veces la gravedad y a cuatro grados Celsius en incrementos de cinco minutos para concentrar el eluant a 500 microlitros o menos. Pipetear la solución proteica hacia arriba y hacia abajo entre los giros para resuspender la proteína y evitar que se conmocione demasiado. Cargue el concentrado en una columna SSC en el búfer.
Ejecuta cromatografía líquida proteica rápida y recoge 300 fracciones de microlitro. A continuación, combine las fracciones pico que contienen el tetrómero TRPC3 visualizado por la señal de absorción UV. Y concéntrate de nuevo a una concentración final de al menos cinco miligramos por mililitro.
El TRPC3 humano es una célula entera solubilizada en una variedad de detergentes con una concentración crítica de micelas de 0,01 a 20 micromolares, y se ejecutó en un Tampón que contiene DDM/CHS. Aunque DDM/CHS muestra la mayor solubilidad de TRPC3 humano, la posición máxima parece demasiado grande para ser el TRPC3 humano tetramérico. Después de la solubilización de células enteras, los residuos de la lysis celular se eliminan y la proteína solubilizada se carga en una columna SSC y se ejecuta en HPLC en detergente DDM/CHS que contiene tampón, para comparar la solubilidad absoluta y el volumen máximo de TRPC3 humano en diferentes condiciones en relación con un control TRPM4.
Todas las diferentes muestras de TRPC3 con solubilizadas de detergente muestran posiciones pico alrededor de 11,9 mililitros, lo que es probable que sea demasiado grande porque la forma tetérica de TRPC3 humano tiene un peso molecular menor que el control humano positivo TRPM4. A continuación, se prueban dos búferes diferentes de solubilización y ejecución que contienen DDM/CHS y digitonina. La proteína que se ejecuta en el tampón que contiene digitonina produce el pico más alto en una posición razonable en relación con el control positivo.
Mientras que una purificación a pequeña escala utilizando 25 mililitros de células muestra varios picos amplios, la proteína muestra las características de un solo canal TRPC3 humano tetramérico en la clasificación 2D por mancha negativa. A continuación, los aditivos se examinan en función del carácter fisiológico del TRPC3 humano. EDTA muestra un notable efecto en la estabilización de TRPC3 humano en una posición de pico tetrérico intacto y aumentó significativamente el número de partículas en el micrográfico crio-EM y disminuyó el ruido en el fondo.
La calidad de los resultados finales depende de una buena solución de problemas de los perfiles FSCC en HPLC. Y al completar todos los pasos de purificación rápidamente, idealmente en un solo día. La determinación estructural, la generación de anticuerpos y los estudios funcionales, como ensayos de unión o electrofisiología, se pueden realizar después de este procedimiento.
Esta técnica puede y se ha adaptado para estudiar otros canales iónicos y familias de proteínas y para producir proteínas purificadas para aplicaciones más allá de la determinación estructural. Se deben tomar las precauciones apropiadas para el manejo de los peligros biológicos de cultivo celular, como trabajar en una capucha de flujo laminar, usar ropa protectora y eliminar adecuadamente los residuos.
