Este protocolo nos permitiu resolver a estrutura do TRPC3 humano, um membro de uma importante, mas subestudada família de canais de íons. A principal vantagem dessa técnica é a alta eficiência com que ela pode ser aplicada para expressar e purificar uma variedade de proteínas, tanto para estudos estruturais quanto funcionais. Este método pode fornecer um sistema eficiente de expressão e purificação de proteínas, para uso no estudo da bioquímica proteica e biofísica e pode ser aplicado a uma grande variedade de canais de íons e outras proteínas de membrana.
Primeiro, verifique a expressão relativa do vírus visualizando a fluorescência GFP do vírus em uma amostra da cultura produtora de vírus. Em um frasco de cultura erlenmeyer de fundo perplexo de tamanho suficiente, prepare um volume desejável de uma cultura de suspensão celular de mamíferos HEK293, a uma concentração de 3,5 a 3,8 milhões de células por mililitro no meio de expressão, complementado com FBS 1% estéril. Adicione 8% por volume de solução de estoque de vírus P2 preparada e incubar em um Shaker Orbital a 37 graus Celsius e 135 RPM.
Às 12 a 18 horas após a infecção adicione 10 milimonas de butara de sódio, incubam a 30 graus Celsius pela quantidade de tempo necessária para a expressão proteica ideal. Depois disso, centrífuga a 2.880 vezes a gravidade por 20 minutos para colher as células. Lave e resuspenja as células em aproximadamente 100 mililitros de TBS por litro de células colhidas.
Centrifugar novamente a 2.880 vezes a gravidade por 20 minutos e coletar a pelota celular. Também colecione pequenas colheitas de pelotas de células mililitros em diferentes pontos de tempo e solubilize por duas horas a quatro graus Celsius com agitação na presença de diferentes detergentes e/ou aditivos. Esclareça essas pequenas amostras de células inteiras solubilizadas por ultracentrifugação a 235.000 vezes a gravidade e a quatro graus Celsius por 10 minutos.
Em seguida, execute-os como 30 amostras de microliter em uma coluna de cromatografia SEC, para determinar o melhor momento para a expressão e as melhores condições de solubilização. Descongele a pelota em 100 mililitros de tampão por litro de células colhidas. Uma vez que as células estejam descongeladas, pipeta ou mexa-as para garantir que a solução seja homogênea.
Deixe as células solubilizar em quatro graus Celsius em um béquer imerso em gelo por duas horas enquanto é agitado por uma barra de agitação. Em seguida, remova qualquer detrito celular por ultracentrifugação a 235.000 vezes a gravidade e a quatro graus Celsius por uma hora. Execute uma amostra de 30 microliter do supernante em uma coluna SCC pelo HPLC para verificar a quantidade de proteína e visualizar a proteína alvo pela saída de sinal GFB.
Aplique a resina de afinidade de cobalto ligada ao supernante contendo a proteína solubilizada em uma coluna gravitacional e colete o fluxo-through. Execute uma amostra de 30 microliter do fluxo em uma coluna SCC para verificar se a proteína está se ligando à resina. Em seguida, lave a resina com 10 volumes de coluna de tampão.
Execute uma amostra de 30 microliter da lavagem em uma coluna SCC para verificar se há perda de proteína. Usando tampão, elute a resina ligada ao TRPC3 humano. Execute uma amostra de 90 microliter do eluante que foi diluída de 1 a 100 em uma coluna SSC para verificar se a proteína foi elucidada e verificar a presença de um sinal GFP na posição correspondente ao tamanho da proteína alvo.
Adicione trombina a uma relação molar de 1 a 20 e adicione 10 milimões de EDTA à amostra elucidada. Incubar a 4 graus Celsius por três horas. Depois disso, transfira o eluante para um tubo de filtro centrífugo de 15 mililitros.
Gire o tubo a 2.800 vezes a gravidade e a quatro graus Celsius em incrementos de cinco minutos para concentrar o eluante a 500 microliters ou menos. Pipeta a solução de proteínas para cima e para baixo entre os giros para resuspensar a proteína e evitar a concentração excessiva. Carregue o concentrado em uma coluna SSC no buffer.
Execute cromatografia líquida de proteína rápida e colete 300 frações de microliter. Em seguida, combine as frações de pico que contêm o tetramer TRPC3 como visualizado pelo sinal de absorção UV. E concentre-se novamente em uma concentração final de pelo menos cinco miligramas por mililitro.
O TRPC3 humano é totalmente solubilizado em uma variedade de detergentes com uma concentração de micela crítica de 0,01 a 20 micromolars, e foi executado em um DDM/CHS contendo buffer. Embora o DDM/CHS mostre a maior solubilidade do TRPC3 humano, a posição máxima parece muito grande para ser o TRPC3 humano tetramédico. Após a solubilização de células inteiras, os detritos de lise celular são removidos e a proteína solubilizada é carregada em uma coluna SSC e executada no HPLC em detergente DDM/CHS contendo tampão, para comparar a solubilidade absoluta e o volume máximo do TRPC3 humano em condições diferentes em relação a um controle TRPM4.
Todas as diferentes amostras de TRPC3 solubilizadas de detergente mostram posições máximas em torno de 11,9 mililitros, o que é provavelmente muito grande porque a forma tetramérica do TRPC3 humano tem um peso molecular menor do que o controle humano positivo TRPM4. Dois buffers de solubilização e execução diferentes contendo DDM/CHS e digitonin são então testados. A proteína executada no tampão contendo digitonina produz o pico mais alto em uma posição razoável em relação ao controle positivo.
Enquanto uma purificação em pequena escala usando 25 mililitros de células mostra vários picos amplos, a proteína mostra características de um único canal trpc3 humano tetramédico em classificação 2D por mancha negativa. Os aditivos são então examinados com base no caráter fisiológico do TRPC3 humano. EDTA mostra um efeito notável na estabilização do TRPC3 humano em uma posição de pico tetramérica intacta e aumentou significativamente o número de partículas no micrografo crio-EM e diminuiu o ruído no fundo.
A qualidade dos resultados finais depende de uma boa solução de problemas dos perfis do FSCC no HPLC. E ao completar todas as etapas de purificação rapidamente, idealmente em um único dia. A determinação estrutural, a geração de anticorpos e estudos funcionais como ensaios de ligação ou eletrofisiologia podem ser realizados após este procedimento.
Essa técnica pode e foi adaptada para estudar outros canais de íons e famílias de proteínas e produzir proteínas purificadas para aplicações além da determinação estrutural. As precauções adequadas para o gerenciamento de bioargrágivos de cultura celular, como trabalhar em uma capa de fluxo laminar, usar roupas protetoras e descartar adequadamente resíduos, devem ser tomadas.
