이 프로토콜을 통해 중요하지만 이온 채널의 부족한 가족인 인간 TRPC3의 구조를 해결할 수 있었습니다. 이 기술의 주요 장점은 구조적 및 기능적 연구를 위해 다양한 단백질을 표현하고 정화하기 위해 적용 될 수있는 고효율입니다. 이 방법은 단백질 생화학 및 생물 물리학 을 연구하는 데 사용하기 위해 효율적인 단백질 발현 및 정제 시스템을 제공 할 수 있으며 다양한 이온 채널 및 기타 멤브레인 단백질에 적용 될 수 있습니다.
먼저, 바이러스생성 배양물의 샘플에서 바이러스의 GFP 형광을 확인하여 상대바이러스 발현을 확인한다. 충분한 크기의 당황한 바닥 에렌마이어 배양플라스크에서, 1%의 멸균 FBS로 보충된 발현 배지에서 밀리리터당 3.5~380만 개의 세포농도로 HEK293 포유류 세포 현탁액 배양의 바람직한 부피를 준비한다. 준비된 P2 바이러스 스톡 솔루션의 부피로 8%를 추가하고 섭씨 37도 및 135 RPM에서 궤도 셰이커에 인큐베이션합니다.
감염 후 12~18시간 동안 10밀리머 나트륨 부티레이트를 추가하고 최적의 단백질 발현에 필요한 시간 동안 섭씨 30도에서 배양합니다. 그 후, 원심분리기는 세포를 수확하기 위해 20분 동안 중력의 2, 880배입니다. 세척 및 수확 세포의 리터 당 TBS의 약 100 밀리리터에서 세포를 다시 중단.
원심분리기는 20분 동안 2, 880배의 중력으로 다시 세포 펠릿을 수집합니다. 또한 다양한 시간 지점에서 작은 1 밀리리터 세포 펠릿수확을 수집하고 다른 세제 및/또는 첨가제의 존재시 동요와 섭씨 4도에서 2 시간 동안 용해. 235, 000 배 중력및 섭씨 4도에서 10 분 동안 초원심 분리에 의해 이러한 작은 전체 세포 용해 샘플을 명확히하십시오.
그런 다음 SEC 크로마토그래피 컬럼에서 30개의 마이크로리터 샘플로 실행하여 발현에 가장 적합한 시간과 최상의 용해성 조건을 결정합니다. 수확된 세포의 리터당 100 밀리리터의 완충제에서 펠릿을 해동합니다. 세포가 해동되면 파이펫을 파기하거나 저어서 용액이 균일하게 유지되도록 합니다.
파동 바에 의해 교반되는 동안 2 시간 동안 얼음에 담근 비커에서 세포가 섭씨 4도에서 용해시키게하십시오. 다음으로, 235, 000배, 섭씨 4도에서 1시간 동안 초원심분리로 세포 잔해를 제거합니다. HPLC에 의해 SCC 컬럼상상피성의 30 마이크로리터 샘플을 실행하여 단백질 양을 확인하고 GFB 신호 출력에 의해 표적 단백질을 시각화한다.
코발트 친화성 수지 결합 된 상체체를 중력 기둥에 용해화 된 단백질을 함유하고 흐름을 수집합니다. 단백질이 수지에 결합되어 있는지 확인하기 위해 SCC 컬럼에서 유량 의 30 마이크로리터 샘플을 실행합니다. 그런 다음 10개의 열 버퍼로 수지를 세척합니다.
SCC 컬럼에서 세척의 30 마이크로리터 샘플을 실행하여 단백질 손실을 확인합니다. 버퍼를 사용하여 수지 바인딩 된 인간 TRPC3을 엘테합니다. SSC 컬럼에서 1 내지 100으로 희석된 용액의 90 마이크로리터 샘플을 실행하여 단백질이 용출되었는지 확인하고 표적 단백질 크기에 대응하는 위치에서 GFP 신호의 존재를 확인한다.
1에서 20 의 어금니 비율로 Thrombin을 추가하고 ETA의 10 밀리몰라를 용출 된 샘플에 추가합니다. 섭씨 4도에서 3시간 동안 배양하세요. 그 후, 용루제를 15 밀리리터 원심 필터 튜브로 옮기십시오.
2, 800 배 중력과 5 분 단위로 섭씨 4도에서 튜브를 회전하여 용액을 500 마이크로 리터 이하로 농축하십시오. 파이펫 단백질 용액은 단백질을 재일시 중단하고 과도하게 집중하는 것을 방지하기 위해 스핀 사이를 위아래로 합니다. 농축을 버퍼의 SSC 열에 로드합니다.
빠른 단백질 액체 크로마토그래피를 실행하고 300 마이크로 리터 분획을 수집합니다. 그런 다음, UV 흡광도 신호에 의해 시각화된 대로 TRPC3 테트라머를 포함하는 피크 분획을 결합한다. 그리고 밀리 리터 당 적어도 5 밀리 그램의 최종 농도에 다시 집중.
인간 TRPC3는 0.01~20마이크로몰라의 임계 미셀 농도를 가진 다양한 세제에서 용해되어, DDM/CHS함유 완충제에서 실행되었다. DDM/CHS는 인간 TRPC3의 가장 높은 용해도를 나타내지만, 피크 위치는 너무 커서 테트라메릭 인간 TRPC3이 됩니다. 전체 세포 용해화 후 세포 용해 파편이 제거되고 용해화된 단백질이 SSC 컬럼에 로드되어 버퍼를 포함하는 DDM/CHS 세제의 HPLC에서 실행되며, TRPM4 대조군과 다른 조건하에서 인간 TRPC3의 절대 용해도 및 피크 볼륨을 비교한다.
모든 다른 세제 용해TRPC3 샘플은 인간 TRPC3의 테트라메릭 형태가 양성 인간 제어 TRPM4보다 더 작은 분자량을 가지고 있기 때문에 너무 큰 약 11.9 밀리리터 의 피크 위치를 보여줍니다. 그런 다음 DDM/CHS 및 디지오닌을 포함하는 두 가지 용해화 및 실행 중인 버퍼를 테스트합니다. 디지오닌을 함유한 완충제에서 실행되는 단백질은 양적 대조군을 기준으로 합리적인 위치에서 가장 높은 피크를 산출합니다.
세포의 25 밀리리터를 사용하여 작은 규모의 정제는 몇몇 넓은 피크를 보여줍니다, 단백질은 음성 얼룩에 의하여 2D 분류에 있는 단 하나 테트라메릭 인간 TRPC3 채널의 특징을 보여줍니다. 첨가제는 인간 TRPC3의 생리적 특성에 따라 검사됩니다. EDTA는 그대로 테트라메릭 피크 위치에서 인간 TRPC3 안정화에 현저한 영향을 나타내며 극저온-EM 현미경 그래프의 입자 수를 크게 증가시키고 백그라운드에서 소음을 감소시켰다.
최종 결과의 품질은 HPLC에서 FSCC 프로파일의 좋은 문제 해결에 따라 달라집니다. 그리고 모든 정화 단계를 신속하게 완료할 때, 이상적으로 하루 만에. 구조적 결정, 항체 생성 및 이러한 기능적 연구, 결합 작용 또는 전기 생리학은 이 절차 후에 수행될 수 있다.
이 기술은 다른 이온 채널 과 단백질 가족을 연구하고 구조적 결단을 넘어 응용 프로그램에 대한 정제 된 단백질을 생산하기 위해 적응되었습니다. 라미나르 유동 후드에서 작업하고, 보호복을 입고, 폐기물을 적절히 처분하는 등 세포 배양 바이오해저드를 관리하기 위한 적절한 예방 조치를 취해야 합니다.
