このプロトコルは、重要な、しかし研究されたイオンチャネルの家族のメンバーであるヒトTRPC3の構造を解決することを可能にしました。この技術の主な利点は、構造と機能の両方の研究のために、様々なタンパク質を発現し、精製するために適用することができる高効率です。この方法は、タンパク質の生化学や生物理学の研究に使用するための効率的なタンパク質発現および精製システムを提供し、多種多様なイオンチャネルおよび他の膜タンパク質に適用することができる。
まず、ウイルス産生培養物のサンプル中のウイルスのGFP蛍光を見て、相対的なウイルス発現を確認する。十分なサイズのバッフル底アーレンマイヤー培養フラスコでは、HEK293哺乳動物細胞懸濁液培養液の望ましい体積を調製し、1ミリリットル当たり35〜380万個の細胞を発現培地中で、1%無菌FBSを添加する。調製されたP2ウイルスストック溶液の体積%を加え、摂氏37度と135 RPMでオービタルシェーカーにインキュベートします。
感染後12〜18時間で10ミリモルのナトリウムブタイレートを加えて、最適なタンパク質発現に必要な時間を摂氏30度でインキュベートする。この後、細胞を収穫するために2、880倍の重力で遠心分離を行った。収穫した細胞の1リットル当たり約100ミリリットルのTBSで細胞を洗浄し、再懸濁させる。
20分間2、880倍の重力で再び遠心分離機を、細胞ペレットを採取する。また、様々な時点で小さな1ミリリットルの細胞ペレットの収穫を収集し、異なる洗剤および/または添加物の存在下で攪拌して摂氏4度で2時間可溶化します。235,000倍の重力で、摂氏4度で10分間超遠心分離することにより、これらの小さな全細胞可溶化サンプルを明確にします。
次に、SECクロマトグラフィーカラムで30マイクロリットルのサンプルとして実行し、発現に最適な時間と最適な可溶化条件を決定します。採取した細胞の1リットル当たり100ミリリットルのバッファーでペレットを解凍します。細胞が解凍されたら、ピペットまたは攪拌して溶液が均質であることを確認します。
細胞を攪拌バーでかき混ぜながら2時間氷に浸したビーカーに摂氏4度で可溶化させます。次に、重力235,000倍、摂氏4度で1時間超遠心分離して細胞デブリを取り除きます。HPLCによるSCCカラム上に30マイクロリットルの上清サンプルを実行し、タンパク質量を確認し、GFBシグナル出力により標的タンパク質を可視化します。
可溶化したタンパク質を含むコバルト親和性樹脂結合上清を重力カラムに塗布し、流量を収集する。SCCカラムでフロースルーの30マイクロリットルサンプルを実行し、タンパク質が樹脂に結合しているかどうかを確認します。その後、10カラムのバッファーで樹脂を洗浄する。
SCCカラムで洗浄の30マイクロリットルサンプルを実行し、タンパク質の損失を確認します。緩衝液を用いて、樹脂結合ヒトTRPC3を溶出する。SSCカラムで1~100個希釈した溶出液の90マイクロリットルサンプルを実行して、タンパク質が溶出していることを確認し、標的タンパク質サイズに対応する位置にGFPシグナルの存在を確認します。
1〜20モル比でトロンビンを追加し、溶出したサンプルにEDTAの10ミリモルを追加します。摂氏4度で3時間インキュベートします。この後、溶出剤を15ミリリットルの遠心フィルターチューブに移します。
チューブを2、800倍の重力、摂氏4度で5分刻みで回転させ、溶出液を500マイクロリットル以下に濃縮します。スピン間のタンパク質溶液を上下にピペットしてタンパク質を再中断し、濃縮を防ぎます。バッファー内の SSC 列に集中をロードします。
高速タンパク質液体クロマトグラフィーを実行し、300マイクロリットルの分画を収集します。次に、UV吸光度信号で視覚化されたTRPC3四トラマーを含むピーク画分を組み合わせます。そして、ミリリットル当たり少なくとも5ミリグラムの最終濃度に再び濃縮する。
ヒトTRPC3は、0.01~20マイクロモルの臨界ミセル濃度を有する様々な洗浄剤で全細胞可溶化し、バッファを含むDDM/CHSで実行した。DDM/CHSはヒトTRPC3の溶解度が最も高いが、ピーク位置が大きすぎて四量体ヒトTRPC3に見えない。細胞全体を可溶化した後、細胞溶解デブリを取り除き、可溶化したタンパク質をSSCカラムにロードし、DDM/CHS洗剤含有緩衝液中のHPLC上で実行し、TRPM4コントロールに対して異なる条件下でヒトTRPC3の絶対溶解度とピーク量を比較する。
異なる洗剤の可溶化TRPC3サンプルはすべて、ヒトTRPC3の四量体形態が正のヒト制御TRPM4よりも分子量が小さいため、11.9ミリリットル前後のピーク位置を示しています。DDM/CHSとデジトニンを含む2つの異なる可溶化および実行中のバッファがテストされます。ジクトンニンを含むバッファーで実行されるタンパク質は、陽性対照に対して妥当な位置で最高のピークを生み出す。
細胞の25ミリリットルを使用して小規模な精製はいくつかの広いピークを示すが、タンパク質は陰性染色による2D分類における単一の四量体ヒトTRPC3チャネルの特徴を示す。添加剤は、ヒトTRPC3の生理学的特徴に基づいてスクリーニングされる。EDTAは、無傷の四量体ピーク位置におけるヒトTRPC3の安定化に顕著な影響を示し、クライオEM顕微鏡写真における粒子数を有意に増加させ、バックグラウンドのノイズを減少させた。
最終結果の品質は、HPLCのFSCCプロファイルのトラブルシューティングに適しています。そして、すべての精製ステップを迅速に完了する上で、理想的には1日で。構造決定、抗体生成、および機能性の研究など、結合アッセイまたは電気生理学は、この手順の後に行うことができる。
この技術は、他のイオンチャネルおよびタンパク質ファミリーを研究し、構造決定を超えた用途に精製タンパク質を生成するために、また、適応され、可能です。層流フードで作業したり、防護服を着用したり、廃棄物を適切に処分するなど、細胞培養バイオハザードを管理するための適切な予防措置を講じる必要があります。
