Este protocolo utiliza todas las características principales de AFM, no conforme a otras técnicas de molécula única. Como resultado, somos capaces de resolver la estructura del nucleosoma a nanoescala. Es importante destacar que la visualización directa de los nucleosomas se realizó en condiciones fisiológicas.
Usando nuestra técnica AFM, recientemente hemos revelado propiedades únicas del nucleosoma centromere que pueden desempeñar un papel en la función de todo el centromere. El método a mostrar se aplica actualmente en nuestro laboratorio para investigar el autoensamble de proteínas asociadas con la formación de agregados amiloideos. Estos agregados proteicos desencadenan el desarrollo de enfermedades devastadoras como el Alzheimer y el Parkinson, por nombrar algunas.
Los métodos de preparación simples también son aplicables a otros complejos de ADN proteico, incluidos sistemas grandes como la maquinaria de replicación del ADN. Aunque se necesitan algunas modificaciones. Con el fin de caracterizar las partículas de nucleosomas a nivel de molécula única utilizando microscopía de fuerza atómica estática y de lapso de tiempo, comience por purificar, ensamblar y validar los nucleosomas como se describe en el protocolo de texto que lo acompaña.
A continuación, prepare la superficie de mica para imágenes AFM estáticas. Para ello, primero prepare una solución de 5 mililitros de APS en agua desionizada. Almacene un mililitro alícuotas de esta solución a cuatro grados centígrados, hasta que sea necesario.
A partir de la solución de stock, prepare una solución APS en funcionamiento para la modificación de mica disolviendo 50 microlitros del stock APS de 50 micromolares en 15 mililitros de agua desionizada destilada. Mezcle la solución y luego llene una cubeta con la solución. A continuación, cortar una por tres pulgadas tiras de mica de láminas de mica de alta calidad.
Compruebe que la pieza se ajuste cuando se coloca diagonalmente en una cubeta. Luego, corta las capas de la mica hasta que ambos lados estén recién cortados, y la pieza sea tan delgada como 0.1 milímetros. Coloque inmediatamente la pieza de mica en la cubeta llena de APS e incubar la mica durante 30 minutos.
Transfiera la pieza de mica a una cubeta llena de agua desionizada destilada y remoje durante 30 segundos. A continuación, utilice el argón para secar completamente ambos lados de la tira de mica APS. Aplique cinta adhesiva de doble cara a varios discos magnéticos y colóquelos a un lado.
Luego, corte el sustrato de mica APS a un centímetro por un centímetro cuadrados, y cúbralos en un plato limpio de Petri. A continuación, prepare tres diluciones de los nucleosomas ensamblados utilizando un tampón filtrado de 0,22 micras que contenga 10 hepes militrolares y cuatro cloruros de magnesio milimiolares a un PH de 7,5. Para limitar la pérdida de nucleosomas, a la baja concentración final, la dilución debe hacerse una a la vez, inmediatamente antes de la deposición en la apS mica.
Depositar de cinco a 10 microlitros de cada muestra de nucleosoma en el centro de una pieza de mica APS y dejar que se incuban durante dos minutos. A continuación, enjuague suavemente la muestra con dos o tres mililitros de agua desionizada destilada para eliminar los componentes del tampón. Y seque la muestra depositada bajo un flujo ligero de argón.
Para empezar, monte una punta en el soporte de la punta de la configuración de AFM. A continuación, monte la primera muestra en la etapa AFM, teniendo cuidado de no ponerse en contacto con la superficie de la muestra. Coloque el láser sobre el voladizo hasta que su suma esté en el máximo y ajuste los valores de desviación vertical y lateral a casi cero.
A continuación, ajuste la sonda AFM para encontrar su frecuencia resonante, ajuste la amplitud de la unidad y establezca el tamaño de la imagen en 100 por 100 nanómetros. Una vez configurado, haga clic en el botón de activación para comenzar el enfoque. Cuando el enfoque se haya completado, optimice gradualmente el punto de ajuste de amplitud hasta que se vea claramente la superficie de la muestra.
A continuación, aumente el tamaño del escaneo a un micrón en un micrón y la resolución a 512 por 512 píxeles. Por último, haga clic en el botón de captura para comenzar la adquisición de imágenes. Utilice pegamento de escáner de varilla de vidrio para conectar una varilla de vidrio a la etapa del escáner AFM.
Deje que se seque durante un mínimo de 10 minutos. Mientras tanto, haz piezas circulares de mica de 0,1 milímetros de espesor con un diámetro de 1,5 milímetros punzonando desde una lámina de mica más grande. Utilice el pegamento de varilla de vidrio de mica AFM de alta velocidad para fijar esta pieza de mica a la varilla de vidrio en el AFM de alta velocidad, y permita que permanezca intacto durante un mínimo de 10 minutos mientras se seca.
A continuación, corte las capas de la mica con una cinta sensible a la presión hasta que se vea una capa bien cortada en la cinta. A continuación, diluir un microlitro de 50 de APS milimotora en 99 microlitros de agua desionizada destilada para hacer una solución APS de 500 micromolares. Depositar 2,5 microlitros de la solución en la superficie de mica recién cortada y dejar que la superficie se funcionalice durante 30 minutos.
Después de la incubación, enjuague la mica varias veces con agua desionizada destilada aplicando tres microlitros enjuagues. Retire el agua completamente después de cada enjuague colocando una toallita no tejida en el borde de la mica. Después del enjuague final, coloque tres microlitros de agua desionizada destilada en la superficie, y déjela reposar durante un mínimo de cinco minutos para eliminar cualquier APS no específicamente ligado.
A continuación, coloque la sonda en el soporte AFM de alta velocidad y coloque el soporte en el escenario AFM con la punta hacia arriba. Enjuague el soporte con 100 microlitros de agua desionizada destilada, seguido de dos enjuagues de 100 microlitros de 0,22 micras de tampón de imágenes nucleosoma filtrados de 0,22 micras. Con los enjuagues realizados, llene la cámara con 100 microlitros de tampón de imágenes nucleosomas, sumergiendo la punta.
Ajuste la posición en voladizo hasta que se golpee con el láser. A continuación, enjuague la mica APS cinco veces con un tampón de imágenes de nucleosoma filtrado, utilizando cuatro microlitros por enjuague. Diluir un microlitro del conjunto de nucleosomas en 250 microlitros de tampón de imágenes de nucleosoma filtrado para una concentración final de nucleosoma de un nanomolar.
Deposite 2,5 microlitros de esta dilución en la superficie y déjelo reposar durante dos minutos. Enjuague la superficie dos veces con cuatro microlitros de tampón de imágenes nucleosomas para evitar el exceso de aglomeración. Después del enjuague final, deje la superficie cubierta de tampón de imágenes.
Ajuste el escáner y la muestra en la parte superior del soporte de la punta para que la muestra esté boca abajo. Para comenzar el enfoque, utilice la función de aproximación automática con la amplitud del punto de ajuste cerca de la amplitud de oscilación libre. Ajuste el punto de ajuste hasta que la superficie esté bien rastreada.
A continuación, establezca el área de la imagen alrededor de 150 por 150 nanómetros en 200 por 200 nanómetros con la tasa de adquisición de datos de alrededor de 300 milisegundos por fotograma de imagen. Como control para el montaje y la deposición, los mononucleosomas H3 fueron preparados y se fueron tomados de imágenes usando AFM estático. Esta imagen proporciona una instantánea de la población de nucleosomas tal como existían momentos antes de la deposición que confirma que los nucelosomas se ensamblaron con éxito.
Con el conjunto de control H3 un éxito, los métodos presentados se aplicaron a continuación al estudio de los nucleosomas CENP-A. Las imágenes estáticas de AFM de esta muestra revelaron que su montaje fue un éxito. A partir de las imágenes estáticas de AFM, se podría caracterizar la altura y el número de giros de los mononucleosomas.
Tanto el ángulo entre los brazos de ADN libres como la longitud de los brazos de ADN libres se utilizan para determinar el número de vueltas de ADN en el nucleosoma individual. Por el contrario, las imágenes AFM de lapso de tiempo de los nucleosomas se pueden utilizar para visualizar el comportamiento general de desenvoltura espontánea de los nucleosomas. A medida que disminuye el número de giro del nucleosoma, también se observa una disminución correspondiente en el volumen del núcleo del nucleosoma.
Además de las imágenes de lapso de tiempo regular, AFM de lapso de tiempo de alta velocidad se puede utilizar para sondear la dinámica nucleosoma más intrincada que se olvida utilizando imágenes de lapso de tiempo estándar. La capacidad de esta técnica para capturar la dinámica durante un largo período de tiempo fue esencial para la visualización de una translocación de larga distancia de un núcleo nucleosoma CENP-A, que fue capturado en el transcurso de 1200 fotogramas. Esta técnica también fue crítica para capturar la rara transferencia de un núcleo de nucleosoma CENP-A de un sustrato de ADN a otro.
La rápida velocidad de captura de imágenes hizo posible la visualización de este evento dinámico, ya que solo se necesitaron varios fotogramas para completarse. En el amplio campo de la cromatina hay un conjunto de preguntas importantes relacionadas con las funciones de las histonas de liger y la ampliación de la histona de la dinámica de la cromatina. Todas estas preguntas pueden ser respondidas utilizando nuestra técnica.
