Este trabajo fue apoyado por el NIH subvenciones GM45916 y GM66834 a JCH, y una beca de la Fundación Internacional del Síndrome de Rett a AK Este trabajo también fue apoyado por el NIH subvención GM088409 y el Instituto Médico Howard Hughes contribuciones a KL

1. Asamblea de recombinantes Core histonas en octamers Justificación: El primer paso para la reconstitución array nucleosomal es preparar octamers histonas nativas de histonas recombinantes liofilizadas. Las proteínas histonas se combinan en cantidades molares iguales y se montan en octámeros histonas dializando las muestras de un tampón desnaturalizante en tampón de replegamiento. <ol><li> Purificar y liofilizar histonas del núcleo recombinantes (H2A, H2B, H3, H4) como se describe 13. </li><li> Disolver aproximadamente 5 mg de cada núcleo de histonas liofilizado en 3 ml de tampón de desarrollo (6 M de guanidina HCl, 20 mM de Tris pH 7,5, DTT 5 mM). Permitir que cada alícuota para disolver durante al menos una hora. Asegúrese de que ninguna proteína permanece en los lados del recipiente. </li><li> Medir la absorbancia de cada histona a 276 nm usando tampón de desplegamiento como una referencia. </li><li> Calcular la molaridad de cada histona utilizando sus coeficientes de extinción (Ver Tabla 1 </strong&gt; para Xenopus coeficientes de extinción de histonas). Comparar la concentración de absorbancia determinado de la histona al peso seco liofilizado, y estimación de si se disuelve la mayor parte de la proteína. </li><li> Determine qué histona usted tiene los topos menor cantidad de, ya que este será el número limitante de moles de todos los histonas. </li><li> Combinar las histonas en cantidades molares iguales y se diluye con tampón de desarrollo a una concentración final de 1 mg / ml. </li><li> Colocar la muestra en un tubo de diálisis de 6-8 kDa MWCO. Sellar el tubo y colocar en 2 L de tampón de replegamiento frío (NaCl 2 M, Tris 10 mM pH 7,5, EDTA 1 mM, 5 mM β-mercaptoetanol). </li><li> Se dializa la muestra durante 18 horas a 4 ° C con agitación. Asegúrese de que el tubo de diálisis puede girar libremente y vigorosamente, o bien las histonas puede precipitar. </li><li> Cambiar el tampón de diálisis dos veces en el período de 18 horas (es decir, cambiar el tampón de replegamiento sobre cada 6 horas hasta que esté hecho). Incluso si se forma precipitado no descartanla muestra, algunos octámero se puede recuperar aunque el rendimiento se reducirá. </li></ol> Nota: Consulte el paso 2.1-2.2 para preparar equilibrado de la columna para el día siguiente. 2. Purificación de histonas octamers por tamaño Cromatografía de exclusión Justificación: Después de concluir con la sección 1, las muestras contendrán octamers histonas, así como otros complejos de histonas como agregados, tetrámeros H3/H4 y dímeros H2A/H2B. Octámeros histonas se pueden purificar lejos de estos otros complejos usando cromatografía de exclusión de tamaño (SEC). <ol><li> Conecte un HiLoad 16/60 Superdex200 16/60 (S200) la columna a un sistema de FPLC. Asegúrese de que las burbujas de aire no entran en el sistema. </li><li> Limpie la columna de la S200 con 0,2 m de agua filtrada. Utilice una velocidad de flujo de 0,3 ml / min y establecer un límite de contrapresión de 0,5 MPa. Asegúrese de que tiene suficiente agua y permitir que la columna de limpiar toda la noche. </li><li> Equilibrar la columna y de muestreo del lazo S200 de la FPLC mediante tampón de replegamiento. Utilice 1 L de 0,2 micras tampón de replegamiento filtrada. Flujo tampón de replegamiento a través de la columna a una velocidad de 1 ml / min y una presión máxima de 0,5 MPa durante aproximadamente 2 h. </li><li> Equilibrar un concentrador centrífugo Vivaspin (50 kDa MWCO) con 1 ml de tampón de replegamiento. Sacar la prueba del tubo de diálisis y centrifugar la muestra a 4 ° C para eliminar cualquier precipitado. Pipetear el sobrenadante de la muestra en el concentrador. Concentrar la muestra hasta un volumen de aproximadamente 500 l. </li><li> Retire la muestra octámero concentrada a un nuevo contenedor y enjuague el concentrador con 1 ml tampón de replegamiento. Se concentra el enjuague hasta 500 l, y agregarlo a la muestra octámero. Esto ayuda a salvar cualquier octámero restante en el concentrador. </li><li> Haga girar la muestra en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml durante 5 minutos a 10.000 rpm a 4 ° C. Se recoge el sobrenadante y transferir a un tubo nuevo. Esto ayuda a eliminar cualquier precipitado antes de cargar la muestra en el FPLC. </li><li> Cargue la muestra en la columna de la S200. Cargue un máximo de 1,5 ml de volumen total o 15 mg octámero en una sola purificación. </li><li> Se eluye la muestra utilizando tampón de replegamiento recién hecho. Utilice una velocidad de flujo de 1 ml / min y un límite de presión de vuelta de 0,5 MPa. Utilice dos volúmenes de columna (400 ml) tampón de replegamiento y recoger fracciones de 2 ml. Supervisar la absorbancia a 280 nm durante la elución. Las diferentes especies se eluir en orden decreciente de tamaño. Agregados histonas generalmente eluyen a aproximadamente 45 ml, octamer en alrededor de 65 ml, y de dímero en alrededor de 84 ml (Figura 1). </li><li> Analizar las fracciones de elución de los picos de interés mediante la ejecución de las muestras en un 18-20% de SDS-PAGE. Las fracciones que contienen octamers purificadas deben tener cantidades molares iguales de las cuatro proteínas histonas (Figura 1). </li><li> Reunir las fracciones que contienen octámeros purificados, y concentrar a ≤ 15 mg / ml con un filtro centrífugo Vivaspin. Si diluida izquierda, octamers pueden disociar idímeros y tetrámeros nto H2A/H2B H3/H4. </li><li> Determinar la concentración de octámero por la medición de la absorbancia a 280 nm y calcular utilizando el coeficiente de extinción de la Tabla 1. </li><li> Octamers histonas pueden mantenerse a corto plazo en el tampón de replegamiento a 4 ° C. Si está almacenado a largo plazo, los octámeros serán más estables a -20 ° C y en una solución de glicerol al 50%. Octamers almacenados en glicerol deben dializaron en tampón de replegamiento fresco antes de las mediciones de absorbancia y uso en reconstrucciones de matriz nucleosomales. </li></ol> 3. Reconstitución de nucleosomal matrices de ADN y se purificó octamers Justificación: La reconstitución de nucleosomal arrays requiere que octamers histonas y ADN molde se combinan en proporciones molares específicos. Las mezclas de ADN y las histonas octámeros en NaCl 2 M son paso dializaron en tampones de fuerza iónica decreciente. Un cambio gradual a la sal inferior asegura la formación de nucleosomas adecuada. La obtención de nmatrices ucleosomal con el nivel deseado de saturación de octámero de histona del ADN molde requiere pequeñas reconstituciones de prueba a escala seguido de una reconstitución preparativa a gran escala. Las condiciones apropiadas definidas por las reconstituciones pequeña escala se utilizan para guiar la reconstitución preparativa. <ol><li> Se purifica ADN de posicionamiento nucleosoma repetidas en tándem como se describe 4,12. Brevemente, aislar el ADN plásmido usando un kit de Qiagen GigaPrep o un producto similar. Establecer un enzima de restricción digerir con el fin de liberar el ADN plantilla y digerir el ADN plásmido a tamaños más pequeños (≤ 700 pb). La plantilla de ADN puede entonces ser purificado lejos de los pequeños restos de ADN plásmido utilizando cromatografía de exclusión de tamaño (SEC). Una columna por gravedad, con una altura de unos 115 cm llenas de perlas Sephacryl S-1000 es suficiente para la purificación de 601 x 207bp DNA 12mer. </li></ol> Notas: Para la purificación de ADN plásmido a un costo disminuyó, pero aumentó efORT, uno puede utilizar lisis alcalina con la purificación de ADN con fenol / cloroformo con el fin de aislar el ADN plásmido a partir de E. coli 23,24. Estrategias para la separación de la plantilla de ADN de plásmido de ADN puede variar con cambios en la plantilla de tamaño de ADN. Para la SEC, es importante establecer la enzima de restricción digerir de una manera que maximiza la diferencia de tamaño entre la plantilla y el ADN plásmido. <ol start="2"><li> Determinar qué relaciones molares (r) a utilizar para la reconstitución. R es igual a la relación de moles de octámero a moles de repetición de ADN. Para los ensayos iniciales a pequeña escala, los valores de r de 0,9, 1 y 1,1 son apropiados si la intención es obtener matrices nucleosomal saturados. </li><li> Preparar las muestras a pequeña escala mediante el cálculo de la cantidad de octámero añadir a aproximadamente 18 mg de ADN para cada relación molar a probar. Mezclar el ADN y las histonas octamers. La concentración final de NaCl en la muestra debe ser ≥ 2 M, y la concentración final de DNA debe estar alrededor de 0,3 mg / l. Las condiciones de tampón de muestra finales también deben incluir 10 mM de Tris pH 7,8, y EDTA 1 mM. </li><li> Las muestras están ahora listas para la diálisis. Cargar las muestras en tubos de diálisis 12k-14k MWCO. Dializar las muestras contra 2 l de tampón de fuerza iónica decreciente de la siguiente manera. </li></ol> Componentes en todos los búferes: 10 mM de Tris pH 7,8, EDTA 1 mM. Buffer 1 (añadir NaCl 1 M, DTT 1 mM) durante 5-6 horas. Buffer 2 (añadir NaCl 0,75 M, DTT 1 mM) durante la noche. Buffer 3 (añadir NaCl 2,5 mM, DTT 1 mM) durante 5-6 horas. Buffer 4 (añadir NaCl 2,5 mM, 0,1 mM PMSF) durante la noche. <ol start="5"><li> Retirar las muestras de los tubos de diálisis y proceder a secciones de 4-6. Si las muestras a pequeña escala producen los resultados deseados, repetir los pasos de las secciones 3-6 en la gran escala. </li></ol> Nota: Con el fin de conservar los recursos, las muestras a pequeña escala deben tener el volumen mínimo necesario para ser suficiente para ensayos de selección de aguas abajo. Con el fin de tener correonough muestra para los experimentos de velocidad de sedimentación y AFM enumerados aquí, 50 l de muestras de ADN en 0.3 mg / ml son apropiados. El tamaño de gran escala, muestras preparativas dependen de su uso previsto. Una muestra a gran escala se debe preparar de la misma manera que las muestras a pequeña escala. 4. Análisis de la velocidad de sedimentación de reconstituido nucleosomal arrays Justificación: Sedimentación experimentos de velocidad en la información de rendimiento ultracentrífuga analítica Beckman XL-A / I sobre el tamaño y la forma de las moléculas en solución. Experimentos de velocidad de sedimentación realizados en condiciones de baja sal se utilizan para determinar el grado en que las matrices reconstituidas se saturan con nucleosomas. <ol><li> Diluir la muestra a una absorbancia alrededor de 0,5 a 260 nm usando tampón TEN (Tris 10 mM pH 7,8, EDTA 1 mM, NaCl 2,5 mM). Carga de 400 l de muestra en una cubeta con una pieza central de dos sectores, con la muestra en un lado y la refeCe (tampón TEN) en el otro 25. Mantenga el menisco de referencia más altos que el menisco de la muestra (es decir, añadir la solución de referencia l 420). </li><li> Cargar las células en el rotor, y alinear las células adecuadamente utilizando las marcas de hash en la parte inferior de las células y el rotor 25. El polvo con cuidado las lentes de las células por medio de aire comprimido. </li><li> Encienda la centrífuga XL-A/XL-I, inserte el rotor, y fije y asegure la óptica como se describe en el manual. Abra el software proteoma Lab y seleccione el archivo: nuevo. </li><li> Configurar una sola corrida de exploración en 3000 rpm y una temperatura de 25 ° C. En Opciones, seleccione la parada después de la última exploración, y la calibración de desviación radial (radial calibración no es necesaria si el rotor fue el último rotor utilizado en el AUC). </li><li> Para cada celda, el nombre de las muestras, seleccione una longitud de onda (260 nm), seleccione absorbancia, y elija una ubicación para guardar el archivo en su computadora. Comience la única prueba de exploración. </li><li> Utilice el ciclo individual para determinar el ra apropiadamarcar la longitud de análisis (Figura 2A). La disminución de la longitud de la célula que se digitalizará disminuye el tiempo de ejecución. Sin embargo, asegúrese de incluir el menisco de la muestra y se extienden al final muy cerca de, o en la parte inferior de la celda. </li></ol> Nota: los análisis individuales permiten que el área de medición para ser acortado por mediciones comenzando justo antes de que el menisco de la muestra (Figura 2A). La mayoría de las exploraciones generadas durante la ejecución de la AUC debe tener fracciones de límites últimos del menisco, así como mesetas estable (Figura 2B). Lentes sucias en las células de las AUC pueden generar imágenes escaneadas con grandes picos, estos pueden afectar el análisis de los datos. El software UltraScan incluye un manual que es un gran recurso para obtener información sobre el análisis de los datos de ultracentrifugación analítica 26. <ol start="7"><li> Uso del panel de control XL-A/XL-I, introduzca una velocidad de 0 y pulse Iniciar. Esto hará que la cámara de centrífuga para tirar de un vacío y todoOW la temperatura de la cámara se equilibre. Espere 1 hora para permitir el equilibrio de temperatura antes de empezar a correr. </li><li> Utilice el software para establecer el plazo para la velocidad y el número de análisis deseado. Las velocidades más altas aumentan la resolución, pero uno debe recoger al menos 20 exploraciones (preferiblemente más) antes de que la muestra ha sedimentado a la parte inferior de la celda. Es conveniente superponer las últimas exploraciones realizadas (en el menú de opciones) con el fin de monitorear el progreso de la carrera y ver si hay problemas potenciales, tales como las células con fugas. Monitorear el primer par de scans para garantizar un funcionamiento correcto. </li></ol> 5. Edición y análisis de datos de la velocidad de sedimentación Justificación: datos de la velocidad de sedimentación Raw deben ser analizados por un programa que produce una distribución coeficiente de sedimentación de difusión corregido. Esta información, a su vez indica la fracción de una muestra reconstituida que contiene un nivel de saturación dada, por ejemplo, </em&gt; si el uso de una plantilla de ADN de 12-mer que será posible determinar la fracción de matrices reconstituidas que tiene 10, 11 y 12 nucleosomas / ADN. <ol><li> Utilice AUC software de análisis de datos, tales como UltraScan para editar los datos 26. Edición de los datos de exploración se debe hacer para cada celda y se crea un conjunto de datos para su posterior análisis. Edición adecuada de exploraciones implica la definición de los meniscos de la muestra, la reducción de los datos a una región de interés, y la definición de la línea de base, así como regiones de meseta (Figura 2). Análisis no deseados también se pueden eliminar de los datos que figuran en este punto. Sin embargo, ya que es posible eliminar las exploraciones no deseados durante el análisis, se recomienda que todos los análisis se mantendrán en este punto. </li><li> Es muy recomendable que la furgoneta método Holde-Weischer mejorada puede utilizar para analizar los datos de 27. Este método de análisis corrige los efectos de la difusión en el transcurso de la carrera y se obtiene la distribución integral de los coeficientes de sedimentación. En particular, El método Holde-Weischer mejorado van (como se aplica en UltraScan) permitirá la inclusión de las exploraciones que carecen de mesetas estables, o que contienen fracciones de límites que no se han debitado el menisco en el análisis 28. </li><li> Determinar la distribución de los coeficientes de sedimentación para las matrices de ensamblados. Los resultados representativos para 601-12 (207bp, 12-mer) nucleosomal arrays se muestran en la Figura 3. </li><li> Si una de las muestras a pequeña escala contiene matrices con el rango deseado de coeficientes de sedimentación, a continuación, repita el proceso en mayor escala a partir de la sección 3. Entonces, si ninguna de las muestras a pequeña escala tiene una distribución adecuada de los coeficientes de sedimentación repetir las pruebas a pequeña escala con una nueva gama r a partir de la sección 3. </li></ol> 6. Visualizar Nucleosomal matrices mediante Microscopía de Fuerza Atómica (AFM) Justificación: AFM permite la visualización del nivel de saturación del nucleosomal matrices. Esta técnica complementa la velocidad de sedimentación por el AUC y la digestión con enzimas de restricción como un ensayo de control de calidad. <ol><li> Usando métodos descritos anteriormente, obtener una matriz de nucleosoma bien saturado (Figura 5A). </li><li> Preparar APTES tratados diapositivas de mica mediante la colocación de ~ 30 l de dilución 1:1.000 de comercial (Sigma-Aldrich (3-aminopropil) trietoxisilano A3648-100 ml) en 0,22 micras agua filtrada nanopura durante 30 min. </li><li> Después de 30 min enjuagar los APTES con agua filtrada y secar suavemente en un flujo de nitrógeno. </li><li> Coloque la muestra matriz nucleosoma apropiadamente diluido (~ 1,5 ng / l) en la diapositiva, e incubar cubierto a temperatura ambiente durante 15 min. </li><li> Enjuagar la muestra con tampón de muestra filtrada, seca como antes, y el lugar de diapositivas en la etapa de la AFM (en este caso una investigación MFP-3D Microscopio de Fuerza Atómica de asilo). </li><li> Comience por imágenes de 2 x 2 m exploraciones con 512 líneas de exploración. Cuente el número de nucleosomas para determinar el nivel de saturación (Figura 5B). </li><li> Lo ideal es que las áreas de imagen en la diapositiva con matrices de nucleosomas bien separados. </li><li> Para las imágenes de mayor resolución, una exploración de 500 x 500 nm se puede obtener (Figura 5C). </li><li> Las imágenes pueden ser aplanadas y analizados utilizando el software de la impresora multifunción en 3D proporcionado por el Asilo. </li><li> Cada imagen puede ser dividida en cuatro cuadrantes y el zoom digital para obtener una visión más clara de las matrices bien separados y múltiples líneas de mano libre se pueden extraer a través de las matrices y perfiles de altura se obtienen de los nucleosomas (Figura 5C, la derecha del panel de altura traza y 5D). </li><li> Varias de estas imágenes deben ser analizados para cada tipo de matriz que abarca varios cientos de nucleosomas. Perfiles de altura se registran, clasifican y se representan gráficamente en MS Excel. </li></ol>

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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+nucleosomes+revealed+by+time-lapse+atomic+force+microscopy.">Dynamics of nucleosomes revealed by time-lapse atomic force microscopy.</a> Biochemistry. 48 (33), 7842-7848 (2009).</li><li>Lohr, D., Bash, R., Wang, H., Yodh, J., Lindsay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+atomic+force+microscopy+to+study+chromatin+structure+and+nucleosome+remodeling.">Using atomic force microscopy to study chromatin structure and nucleosome remodeling.</a> Methods (San Diego, Calif). 41 (3), 333-341 (2007).</li><li>Dyer, P. N., Edayathumangalam, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+nucleosome+core+particles+from+recombinant+histones+and+DNA.">Reconstitution of nucleosome core particles from recombinant histones and DNA.</a> Methods in Enzymology. 375, 23-44 (2004).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (2001).</li><li>Balbo, A., Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly,+loading,+and+alignment+of+an+analytical+ultracentrifuge+sample+cell.">Assembly, loading, and alignment of an analytical ultracentrifuge sample cell.</a> J. Vis. Exp. (33), e1530 (2009).</li><li>Demeler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UltraScan:+a+comprehensive+data+analysis+software+package+for+analytical+ultracentrifugation+experiments.">UltraScan: a comprehensive data analysis software package for analytical ultracentrifugation experiments.</a> Modern Analytical Ultracentrifugation: Techniques. , 210-230 (2005).</li><li>Holde, K. V., Weischet, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boundary+analysis+of+sedimentation+velocity+experiments+with+monodisperse+and+paucidisperse+solutes.">Boundary analysis of sedimentation velocity experiments with monodisperse and paucidisperse solutes.</a> Biopolymers. 17 (6), 1387-1403 (1978).</li><li>Demeler, B., van Holde, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sedimentation+velocity+analysis+of+highly+heterogeneous+systems.">Sedimentation velocity analysis of highly heterogeneous systems.</a> Analytical Biochemistry. 335, 279-288 (2004).</li><li>Hansen, J., Lohr, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+structural+properties+of+subsaturated+chromatin+arrays.">Assembly and structural properties of subsaturated chromatin arrays.</a> Journal of Biological Chemistry. 8, 5840-5848 (1993).</li><li>Routh, A., Sandin, S., Rhodes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleosome+repeat+length+and+linker+histone+stoichiometry+determine+chromatin+fiber+structure.">Nucleosome repeat length and linker histone stoichiometry determine chromatin fiber structure.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 105 (26), 8872-8877 (2008).</li><li>Zhou, J., Fan, J. Y., Rangasamy, D., Tremethick, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nucleosome+surface+regulates+chromatin+compaction+and+couples+it+with+transcriptional+repression.">The nucleosome surface regulates chromatin compaction and couples it with transcriptional repression.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 14 (11), 1070-1076 (2007).</li><li>Dorigo, B., Schalch, T., Kulangara, A., Duda, S., Schroeder, R. R., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleosome+arrays+reveal+the+two-start+organization+of+the+chromatin+fiber.">Nucleosome arrays reveal the two-start organization of the chromatin fiber.</a> Science (New York, N.Y.). 306 (5701), 1571-1573 (2004).</li><li>Correll, S. J., Schubert, M. H., Grigoryev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Short+nucleosome+repeats+impose+rotational+modulations+on+chromatin+fibre+folding.">a Short nucleosome repeats impose rotational modulations on chromatin fibre folding.</a> The EMBO Journal. 31 (10), 2416-2426 (2012).</li><li>Mcbryant, S. J., Krause, C., Woodcock, C. L., Hansen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Silent+Information+Regulator+3+Protein+,+SIR3p+,+Binds+to+Chromatin+Fibers+and+Assembles+a+Hypercondensed+Chromatin+Architecture+in+the+Presence+of+Salt.">The Silent Information Regulator 3 Protein , SIR3p , Binds to Chromatin Fibers and Assembles a Hypercondensed Chromatin Architecture in the Presence of Salt.</a> Molecular and Cellular Biology. 28 (11), 3563-3572 (2008).</li><li>Schalch, T., Duda, S., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+structure+of+a+tetranucleosome+and+its+implications+for+the+chromatin+fibre.">X-ray structure of a tetranucleosome and its implications for the chromatin fibre.</a> Nature. 436 (7047), 138-1341 (2005).</li><li>Fan, J. Y., Gordon, F., Luger, K., Hansen, J. C., Tremethick, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+essential+histone+variant+H2A.Z+regulates+the+equilibrium+between+different+chromatin+conformational+states.">The essential histone variant H2A.Z regulates the equilibrium between different chromatin conformational states.</a> Nature Structural Biology. 9 (3), 172-176 (2002).</li><li>Carruthers, L. M., Bednar, J., Woodcock, C. L., Hansen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linker+histones+stabilize+the+intrinsic+salt-dependent+folding+of+nucleosomal+arrays:+mechanistic+ramifications+for+higher-order+chromatin+folding.">Linker histones stabilize the intrinsic salt-dependent folding of nucleosomal arrays: mechanistic ramifications for higher-order chromatin folding.</a> Biochemistry. 37 (42), 14776-14787 (1998).</li><li>Huynh, V. A. T., Robinson, P. J. J., Rhodes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+for+the+In+Vitro+Reconstitution+of+a+Defined+&amp;#34;30+nm&amp;#34;+Chromatin+Fibre+Containing+Stoichiometric+Amounts+of+the+Linker+Histone.">A Method for the In Vitro Reconstitution of a Defined &amp;#34;30 nm&amp;#34; Chromatin Fibre Containing Stoichiometric Amounts of the Linker Histone.</a> Journal of Molecular Biology. 345 (5), 957-968 (2005).</li><li>Dorigo, B., Schalch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+fiber+folding:+requirement+for+the+histone+H4+N-terminal+tail.">Chromatin fiber folding: requirement for the histone H4 N-terminal tail.</a> J. Mol. Biol. 2836 (03), 85-96 (2003).</li><li>Qian, R. L., Liu, Z. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+chromatin+folding+patterns+in+chicken+erythrocytes+by+atomic+force+microscopy+(AFM.">Visualization of chromatin folding patterns in chicken erythrocytes by atomic force microscopy (AFM.</a> Cell Research. 7 (2), 143-150 (1997).</li></ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses.

Nucleosomal arrays modelo son una herramienta muy útil para el estudio in vitro de la estructura y función de la cromatina. Por ejemplo, han sido ampliamente usado para estudiar el mecanismo de la fibra de cromatina de condensación en solución 30-34, y hecho posible la obtención de una estructura de rayos x de un Tetranucleosome 35. Más recientemente han demostrado ser útiles en el desciframiento de los efectos estructurales de las variantes de las histonas núcleo específico, muta...

Genomas eucariotas no existen como ADN desnudo, sino que más bien se compactan y organizados por proteínas unidas. Estos complejos de ADN y de proteínas se conocen como cromatina. La unidad de repetición básica de la cromatina es el nucleosoma. Un nucleosoma consta de octámero de histonas y 146 pares de bases de ADN enrollado alrededor del octámero de histonas alrededor de 1,6 veces 1. El octámero de histona se compone de dos copias de cada uno de la H2A histonas del núcleo, H2B, H3, y H4. Octamers histonas centrales que son repetidamente espaciados a lo largo de una molécula de ADN se denominan matrices nucleosomal. La estructura extendida de matrices nucleosomal se ha referido como la fibra de 10 nm o las &quot;cuentas en una cadena&quot; estructura y está presente in vitro bajo condiciones de poca sal 2. La fibra de 10 nm es capaz de condensar en estructuras de orden superior a través de la compactación dentro de la matriz y / o inter-array oligomerización 2. Estas estructuras de orden superior pueden ser inducidas en presencia de sales,o puede ser influenciada a través de la unión de las proteínas de arquitectura de la cromatina a la matriz nucleosomal 3,4. Los niveles de compactación de la cromatina se correlacionan inversamente con la tasa de transcripción en 5,6 vivo. La investigación reciente pone de relieve la importancia de la organización estructural de los genomas en procesos tales como la diferenciación, el desarrollo del cáncer, y otros 7,8. El uso de matrices nucleosomal para estudiar la estructura y función de la cromatina se ha generalizado. Aquí se describe un método para el montaje de matrices nucleosomal de histonas y el ADN recombinante posicionamiento de nucleosomas. El uso de ADN recombinante con repeticiones en tándem de secuencias de posicionamiento de nucleosomas permite la reconstitución de matrices que contienen nucleosomas regularmente espaciados. Dos de las secuencias de posicionamiento más populares son la secuencia del gen 5S rRNA y el &quot;601&quot; secuencia de 9,10. La secuencia 601 se deriva a partir de experimentos de SELEX y More posiciona fuertemente nucleosomas que la secuencia 5S 11. En consecuencia, la longitud del ADN enlazador de las matrices 601 es más homogénea. El posicionamiento de nucleosomas ADN repetidas en tándem se obtiene por filtración en gel 4,12. Histonas recombinantes se purificaron a partir de E. coli en condiciones de desnaturalización 13. El uso de las histonas recombinantes permite controlar cuidadosamente la composición de la histona de las matrices nucleosomal. Por ejemplo, el núcleo de histonas teniendo mutaciones específicas 14 o las modificaciones posteriores a la traducción 15,16 puede ser sustituido por histonas de tipo salvaje. Experimentos de velocidad de sedimentación supervisar la tasa de sedimentación de las macromoléculas en solución bajo una fuerza centrífuga aplicada 17. Esto produce información sobre el tamaño y la forma de las macromoléculas en una muestra. Experimentos de velocidad de sedimentación son, pues, un instrumento adecuado para el estudio de los cambios de estado de soluciones en fibra de cromatinaestructura debido a la condensación de la cromatina 18. Es importante destacar que, en primer lugar es necesario el uso de experimentos de velocidad de sedimentación como un paso de control de calidad en la reconstitución matriz nucleosomal. Si el ADN y nucleosomas no se combinan en la proporción molar adecuado, las formaciones pueden ser sub o sobre-saturado de histonas. Por lo tanto, la información obtenida a partir de experimentos de velocidad de sedimentación se utiliza para asegurar que el ADN está saturado correctamente con nucleosomas. Es importante utilizar métodos alternativos para estimar la saturación de ADN con nucleosomas, especialmente si se trabaja con una plantilla de ADN no caracterizado previamente. Por lo tanto, también se describe un método para el análisis de matrices nucleosomal utilizando microscopía de fuerza atómica (AFM). AFM es una técnica poderosa que permite la visualización de los efectos de una serie de parámetros, tales como el nivel de saturación, efecto de la presencia de variantes de histonas o los efectos de MgCl 2 19,20. AFM también ha sido aplied para estudiar la dinámica de nucleosomas utilizando imágenes de lapso de tiempo 21. In vitro reunidos nucleosomal arrays 12-mer son particularmente susceptibles a los estudios de AFM porque pertenecen en el rango de tamaño adecuado para imágenes de AFM 22. En el presente estudio hemos utilizado AFM de matrices nucleosomal como control de calidad, así como un medio de afirmación de los datos de AUC (&quot;ver para creer&quot;). Además de la visualización sencilla, AFM permite la medición de perfiles de altura de muestras como una métrica adicional.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>(3-Aminopropyl)triethoxysilane</td>
 <td>Sigma-Aldrich </td>
 <td>A3648-100ML</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6-8 kDa MWCO Dialysis Tubing</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>21-152-5</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HiLoad Superdex 200 16/60 Column</td>
 <td>GE</td>
 <td>17-1069-01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vivaspin 50 kDa MWCO Centrifugal Concentrator</td>
 <td>Sartorius</td>
 <td>VS2031</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>12-14 kDa MWCO Dialysis Tubing</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>08-667A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Illustra Sephacryl S-1000 Superfine</td>
 <td>GE</td>
 <td>17-0476-01 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>XL-A/I Analytical Ultracentrifuge</td>
 <td>Beckman-Coulter</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

assembly of nucleosomal arrays from recombinant core histones and nucleosome positioning dna

Octamers histonas centrales que son repetidamente espaciados a lo largo de una molécula de ADN se denominan matrices nucleosomal. Nucleosomal arrays se obtienen en una de dos maneras: la purificación a partir de fuentes in vivo, o la reconstitución in vitro de histonas del núcleo recombinantes y de ADN posicionamiento nucleosoma repetidas en tándem. El último método tiene la ventaja de permitir para el montaje de un uniforme más de composición y matriz nucleosomal posicionado con precisión. Experimentos de velocidad de sedimentación en la información de rendimiento ultracentrífuga analítica sobre el tamaño y la forma de las macromoléculas mediante el análisis de la tasa a la que migran a través de la solución bajo la fuerza centrífuga. Esta técnica, junto con microscopía de fuerza atómica, se puede utilizar para el control de calidad, garantizando que la mayoría de las plantillas de ADN están saturados con nucleosomas después de la reconstitución. Aquí se describen los protocolos necesarios para reconstituir cantidades de miligramos de longitud y compositivamente dnucleosomal arrays efined adecuados para los estudios bioquímicos y biofísicos de la estructura y función de la cromatina.

Para ilustrar el protocolo que reconstituido nucleosomal arrays de histonas del núcleo de Xenopus recombinantes y ADN que consiste en 12 repeticiones tándem de 207 pb de la secuencia 601 de posicionamiento (601 207 x 12). En primer lugar, reunido octámeros nativos de histonas del núcleo liofilizadas y después se purificó los octámeros mediante FPLC utilizando una columna S200 (Figura 1A). Complejos más grandes eluyen antes de la columna de la S200. Las histonas se eluyen gene...

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Assembly of Nucleosomal Arrays from Recombinant Core Histones and Nucleosome Positioning DNA

Se presenta un método para la reconstitución del modelo nucleosomal arrays de histonas y el ADN recombinante posicionamiento de nucleosomas en tándem repetido. También describe cómo se utilizan los experimentos de velocidad de sedimentación en la ultracentrífuga analítica y microscopía de fuerza atómica (AFM) para supervisar el grado de saturación de gama nucleosomal después de la reconstitución.

Asamblea de Nucleosomal Arrays de recombinantes Core histonas y el ADN posicionamiento de nucleosomas

Core histone octamers that are repetitively spaced along a DNA molecule  are called nucleosomal arrays. Nucleosomal arrays are obtained in one of two  ...

assembly-nucleosomal-arrays-from-recombinant-core-histones-nucleosome

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22.4K vistas.  Colorado State University.  Se presenta un método para la reconstitución del modelo nucleosomal arrays de histonas y el ADN recombinante posicionamiento de nucleosomas en tándem repetido. También describe cómo se utilizan los experimentos de velocidad de sedimentación en la ultracentrífuga analítica y microscopía de fuerza atómica (AFM) para supervisar el grado de saturación de gama nucleosomal después de la reconstitución. 

Video: Assembly of Nucleosomal Arrays from Recombinant Core Histones and Nucleosome Positioning DNA

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

El aislamiento de ADN genómico de colas de ratón

Investigación

Biología

Combining QD-FRET and Microfluidics to Monitor DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically functional inside the cell, nucleic acid-based therapeutics require an efficient intracellular delivery system. One widely adopted approach is to complex DNA with a gene carrier to form nanocomplexes via electrostatic self-assembly, facilitating cellular uptake of DNA while protecting it against degradation. The challenge lies in the rational design of efficient gene carriers, since premature dissociation or overly stable binding would be detrimental to the cellular uptake and therapeutic efficacy. Nanocomplexes synthesized by bulk mixing showed a diverse range of intracellular unpacking and trafficking behavior, which was attributed to the heterogeneity in size and stability of nanocomplexes. Such heterogeneity hinders the accurate assessment of the self-assembly kinetics and adds to the difficulty in correlating their physical properties to transfection efficiencies or bioactivities. We present a novel convergence of nanophotonics (i.e. QD-FRET) and microfluidics to characterize the real-time kinetics of the nanocomplex self-assembly under laminar flow. QD-FRET provides a highly sensitive indication of the onset of molecular interactions and quantitative measure throughout the synthesis process, whereas microfluidics offers a well-controlled microenvironment to spatially analyze the process with high temporal resolution (~milliseconds). For the model system of polymeric nanocomplexes, two distinct stages in the self-assembly process were captured by this analytic platform. The kinetic aspect of the self-assembly process obtained at the microscale would be particularly valuable for microreactor-based reactions which are relevant to many micro- and nano-scale applications. Further, nanocomplexes may be customized through proper design of microfludic devices, and the resulting QD-FRET polymeric DNA nanocomplexes could be readily applied for establishing structure-function relationships. 

We present a novel and powerful integration of nanophotonics (QD-FRET) and microfluidics to investigate the formation of polyelectrolyte polyplexes, which is expected to provide better control and synthesis of uniform and customizable polyplexes for future nucleic acid-based therapeutics.

La combinación de QD-FRET y microfluídica para monitorear Nanocomplex ADN auto-ensamblado en tiempo real

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically ...

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed centrifugation. When properly planned and executed, an AUC sedimentation velocity or sedimentation equilibrium experiment can reveal a great deal about a protein in regards to size and shape, sample purity, sedimentation coefficient, oligomerization states and protein-protein interactions.
This technique, however, requires a rigorous level of technical attention. Sample cells hold a sectored center piece sandwiched between two window assemblies. They are sealed with a torque pressure of around 120-140 in/lbs. Reference buffer and sample are loaded into the centerpiece sectors and then after sealing, the cells are precisely aligned into a titanium rotor so that the optical detection systems scan both sample and reference buffer in the same radial path midline through each centerpiece sector while rotating at speeds of up to 60, 000 rpm and under very high vacuum
Not only is proper sample cell assembly critical, sample cell components are very expensive and must be properly cared for to ensure they are in optimum working condition in order to avoid leaks and breakage during experiments. Handle windows carefully, for even the slightest crack or scratch can lead to breakage in the centrifuge. The contact between centerpiece and windows must be as tight as possible; i.e. no Newton s rings should be visible after torque pressure is applied. Dust, lint, scratches and oils on either the windows or the centerpiece all compromise this contact and can very easily lead to leaking of solutions from one sector to another or leaking out of the centerpiece all together. Not only are precious samples lost, leaking of solutions during an experiment will cause an imbalance of pressure in the cell that often leads to broken windows and centerpieces. In addition, plug gaskets and housing plugs must be securely in place to avoid solutions being pulled out of the centerpiece sector through the loading holes by the high vacuum in the centrifuge chamber. Window liners and gaskets must be free of breaks and cracks that could cause movement resulting in broken windows.
This video will demonstrate our procedures of sample cell assembly, torque, loading and rotor alignment to help minimize component damage, solution leaking and breakage during the perfect AUC experiment.

The analytical ultracentrifuge (AUC) sample cell holds sample and reference buffer and during experiments and is exposed to high vacuum and rotor speeds up to 60,000 rpm. This video will demonstrate the rigorous attention to detail necessary for assembly, loading and alignment of this very important component of an AUC experiment.

Concentración, la carga, y la alineación de una célula de ultracentrifugación analítica de muestras

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with nutrient and energy flow within terrestrial ecosystems. Cultivation-independent environmental genomic, also known as metagenomic, approaches promise unprecedented access to this genetic information with respect to pathway reconstruction and functional screening for high value therapeutic and biomass conversion processes. However, the soil microbiome still remains a challenge largely due to the difficulty in obtaining high molecular weight DNA of sufficient quality for large insert library production. Here we introduce a protocol for extracting high molecular weight, microbial community genomic DNA from soils and sediments. The quality of isolated genomic DNA is ideal for constructing large insert environmental genomic libraries for downstream sequencing and screening applications. 
The procedure starts with cell lysis. Cell walls and membranes of microbes are lysed by both mechanical (grinding) and chemical forces (&beta;-mercaptoethanol). Genomic DNA is then isolated using extraction buffer, chloroform-isoamyl alcohol and isopropyl alcohol. The buffers employed for the lysis and extraction steps include guanidine isothiocyanate and hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) to preserve the integrity of the high molecular weight genomic DNA. Depending on your downstream application, the isolated genomic DNA can be further purified using cesium chloride (CsCl) gradient ultracentrifugation, which reduces impurities including humic acids. The first procedure, extraction, takes approximately 8 hours, excluding DNA quantification step. The CsCl gradient ultracentrifugation, is a two days process. During the entire procedure, genomic DNA should be treated gently to prevent shearing, avoid severe vortexing, and repetitive harsh pipetting.

A methodology to isolate high molecular weight and high quality genomic DNA from soil microbial community is described.

La extracción de ADN de alta molecular genómico de peso de los suelos y los sedimentos

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

Captura selectiva de 5-hidroximetilcitosina a partir de ADN genómico

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays

Chemostats are continuous culture systems in which cells are grown in a tightly controlled, chemically constant environment where culture density is constrained by limiting specific nutrients.1,2 Data from chemostats are highly reproducible for the measurement of quantitative phenotypes as they provide a constant growth rate and environment at steady state. For these reasons, chemostats have become useful tools for fine-scale characterization of physiology through analysis of gene expression3-6 and other characteristics of cultures at steady-state equilibrium.7 Long-term experiments in chemostats can highlight specific trajectories that microbial populations adopt during adaptive evolution in a controlled environment. In fact, chemostats have been used for experimental evolution since their invention.8 A common result in evolution experiments is for each biological replicate to acquire a unique repertoire of mutations.9-13 This diversity suggests that there is much left to be discovered by performing evolution experiments with far greater throughput. 
We present here the design and operation of a relatively simple, low cost array of miniature chemostats&mdash;or ministats&mdash;and validate their use in determination of physiology and in evolution experiments with yeast. This approach entails growth of tens of chemostats run off a single multiplexed peristaltic pump. The cultures are maintained at a 20 ml working volume, which is practical for a variety of applications. It is our hope that increasing throughput, decreasing expense, and providing detailed building and operation instructions may also motivate research and industrial application of this design as a general platform for functionally characterizing large numbers of strains, species, and growth parameters, as well as genetic or drug libraries.

We developed and validated a small-footprint array of miniature chemostats built from readily available parts for low cost. Physiological and experimental evolution results were similar to larger volume chemostats. The ministat array provides a compact, inexpensive, and accessible platform for traditional chemostat experiments, functional genomics, and chemical screening applications.

Diseño y uso de arrays de quimiostato multiplexados

Chemostats are continuous culture systems in which cells are grown in a tightly controlled, chemically constant environment where culture density is ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and the control of gene transcription in the cell nucleus. The kindlins are ~75 kDa multidomain proteins and bind to an NPxY motif and upstream T/S cluster of the integrin &#946;-subunit cytoplasmic tail. The hematopoietically-important kindlin isoform, kindlin-3, is critical for platelet aggregation during thrombus formation, leukocyte rolling in response to infection and inflammation and osteoclast podocyte formation in bone resorption. Kindlin-3&#39;s role in these processes has resulted in extensive cellular and physiological studies. However, there is a need for an efficient method of acquiring high quality milligram quantities of the protein for further studies. We have developed a protocol, here described, for the efficient expression and purification of recombinant murine kindlin-3 by use of a baculovirus-driven expression system in Sf9 cells yielding sufficient amounts of high purity full-length protein to allow its biophysical characterization. The same approach could be taken in the study of the other mammalian kindlin isoforms.

Kindlins are fundamental to cell adhesion through integrins but studies of them have been hampered by the difficulty encountered in expressing them recombinantly in bacterial hosts. We describe here methods for their efficient production in baculovirus-infected insect cells.

Producción eficiente y purificación de recombinante murino kindlin-3 a partir de células de insecto para estudios biofísicos

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

Imágenes en tiempo real de Soltero Engineered ARN transcritos en células vivas utilizando Ratiometric bimoleculares Balizas

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble unimers below a characteristic transition temperature and aggregating into micron-scale coacervates above their transition temperature. The design of elastin-like polypeptides at the genetic level permits precise control of their sequence and length, which dictates their thermal properties. Elastin-like polypeptides are used in a variety of applications including biosensing, tissue engineering, and drug delivery, where the transition temperature and biopolymer architecture of the ELP can be tuned for the specific application of interest. Furthermore, the lower critical solution temperature phase transition behavior of elastin-like polypeptides allows their purification by their thermal response, such that their selective coacervation and resolubilization allows the removal of both soluble and insoluble contaminants following expression in Escherichia coli. This approach can be used for the purification of elastin-like polypeptides alone or as a purification tool for peptide or protein fusions where recombinant peptides or proteins genetically appended to elastin-like polypeptide tags can be purified without chromatography. This protocol describes the purification of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions and discusses basic characterization techniques to assess the thermal behavior of pure elastin-like polypeptide products.

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are stimulus-responsive biopolymers with applications ranging from recombinant protein purification to drug delivery. This protocol describes the purification and characterization of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions from Escherichia coli using their lower critical solution temperature phase transition behavior as a simple alternative to chromatography.

La purificación no cromatográfico de polipéptidos recombinantes Elastina-como y sus fusiones con Péptidos y Proteínas de<em&gt; Escherichia coli</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Amplificación, secuenciación de próxima generación, y Genómica Mapeo de ADN retrovirales sitios de integración

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...