이 프로토콜은 AFM의 모든 주요 기능을 활용, 다른 단일 분자 기술에 비 준수. 그 결과, 우리는 나노 규모에서 뉴클레오소종의 구조를 해결할 수 있다. 중요한 것은, 뉴클레오좀의 직접적인 시각화는 생리학적 조건에서 이루어졌다.
우리의 AFM 기술을 사용하여, 우리는 최근에 전체 센트로메트어의 기능에 역할을 할 수있는 중계 뉴클레오종의 독특한 특성을 공개했다. 표시되는 방법은 현재 아밀로이드 골재의 형성과 관련된 단백질의 자기 조립을 조사하기 위해 실험실에서 적용됩니다. 이 단백질 집계는 알츠하이머병과 파킨슨병과 같은 치명적인 질병의 발달을 유발하여 몇 가지 이름을 지정합니다.
간단한 준비 방법은 DNA 복제 기계와 같은 대형 시스템을 포함하여 그밖 단백질 DNA 복합체에도 적용됩니다. 일부 수정이 필요하지만. 정적 및 시간 경과 원자력 현미경을 사용하여 단일 분자 수준에서 뉴클레오소성 입자를 특성화하기 위해, 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 뉴클레오좀을 정화, 조립 및 검증하는 것으로 시작한다.
다음으로, 정적 AFM 이미징을 위해 운하 표면을 준비합니다. 이렇게 하려면 먼저 50 밀리머 APS 스톡 솔루션을 탈온수로 준비하십시오. 필요할 때까지 이 솔루션의 1밀리리터 알리쿼트1개를 섭씨 4도에 저장합니다.
스톡 솔루션에서 증류제 증분 수의 15 밀리리터에 50 마이크로몰라 APS 재고의 50 마이크로리터를 용해하여 현미경 수정을 위한 작동 APS 솔루션을 준비하십시오. 솔루션을 혼합한 다음 큐벳을 솔루션으로 채웁니다. 다음으로, 고품질 의 운마 시트에서 운구의 3 센티미터 스트립을 하나씩 잘라.
큐벳에 대각선으로 배치할 때 조각이 맞는지 확인하십시오. 그런 다음, 양면이 갓 갈라지고 조각이 0.1 밀리미터만큼 얇을 때까지 운모의 층을 갈라주세요. 즉시 APS 채워진 큐벳에 마우스 조각을 놓고 30 분 동안 운하를 배양.
미카 조각을 증류수로 채워진 큐벳으로 옮기고 30초 동안 담가 둡니다. 그런 다음 ARgon을 사용하여 APS 운하 스트립의 양쪽을 완전히 건조시십시오. 여러 개의 마그네틱 퍽에 두 개의 얼굴 접착제 테이프를 적용하고 측면에 배치합니다.
그런 다음 APS 운모 기판을 1센티미터로 1센티미터로 자르고 깨끗한 페트리 접시에 덮습니다. 다음으로, 7.5의 PH에서 10 밀리머 헤페와 4밀리머 마그네슘염화물을 함유한 0.22 미크론 여과 버퍼를 사용하여 조립된 뉴클레오좀의 3개의 희석을 준비한다. 뉴클레오좀의 손실을 제한하기 위해, 낮은 최종 농도에서, 희석은 APS 운모에 증착 직전에 한 번에 하나씩 수행해야한다.
APS 마우스 조각의 중심에 각 뉴클레오소성 샘플의 5~10마이크로리터를 보관하고 2분 동안 배양하게 하십시오. 그런 다음, 부드럽게 버퍼 구성 요소를 제거하기 위해 증류 된 탈온 된 물의 2 ~ 3 밀리리터로 샘플을 헹구십시오. 그리고 아르곤의 가벼운 흐름하에서 증착된 샘플을 건조시.
먼저 AFM 설정의 팁 홀더에 팁을 장착합니다. 그런 다음 AFM 단계에 첫 번째 샘플을 장착하여 샘플 표면에 접촉하지 않도록 주의하십시오. 합계가 최대화될 때까지 캔틸레버 위에 레이저를 배치하고 수직 및 측면 편향 값을 거의 0으로 조정합니다.
그런 다음 AFM 프로브를 조정하여 공진 주파수를 찾고, 드라이브 진폭을 조정하고, 이미지 크기를 100 x 100 나노미터로 설정합니다. 설정이 완료되면 참여 버튼을 클릭하여 접근 방식을 시작합니다. 접근방식이 완료되면 샘플 표면이 명확하게 보일 때까지 진폭 세트점을 점진적으로 최적화합니다.
이어서, 스캔 크기를 1미크론으로 늘리고 512x512픽셀로 분해능을 늘립니다. 마지막으로 캡처 버튼을 클릭하여 이미지 수집을 시작합니다. 유리 막대 스캐너 접착제를 사용하여 AFM 스캐너 단계에 유리 막대를 부착합니다.
이 것을 최소 10분 동안 건조시키십시오. 한편, 더 큰 운하 시트에서 펀치하여 직경 1.5 밀리미터의 0.1 밀리미터 두께의 원형 조각을 만듭니다. 고속 AFM 운하 유리 막대 접착제를 사용하여 이 운하 조각을 고속 AFM의 유리 막대에 부착하고 건조하는 동안 최소 10 분 동안 그대로 유지하십시오.
그런 다음, 테이프에 잘 갈라진 층이 보일 때까지 압력 민감 테이프를 사용하여 마이크에서 층을 갈라. 다음으로, 증류제 의 99 마이크로 리터에 50 밀리머 APS 재고의 하나의 마이크로 리터를 희석500 마이크로 몰러 APS 솔루션을 만들기 위해. 갓 갈라진 운하 표면에 용액의 2.5 마이크로리터를 보관하고 표면이 30분 동안 기능하게 합니다.
인큐베이션에 따라 3개의 마이크로리터 헹구기를 적용하여 증류된 탈이온화된 물로 여러 번 헹구는 다. 미혼수 닦아서 각 헹구는 물에 완전히 따라 물을 제거합니다. 마지막 헹구기 후에는 증류된 탈온화된 물 3편을 표면에 놓고 최소 5분간 앉아서 특별히 결합되지 않은 APS를 제거합니다.
다음으로, 프로브를 고속 AFM 홀더에 놓고 팁이 위로 향하여 AFM 스테이지에 홀더를 배치합니다. 증류된 탈이온수 100마이크로리터를 사용하여 홀더를 헹구고, 그 다음으로 0.22 미크론 여과뉴클레오성 이미징 버퍼의 100마이크로리터 헹구기. 헹구는 것으로 챔버를 100마이크로리터의 뉴클레오성 이미징 버퍼로 채우고 팁을 가라앉힙니다.
레이저에 맞을 때까지 캔틸레버 위치를 조정합니다. 그런 다음, 여과된 뉴클레오소성 이미징 버퍼로 APS 운하를 5회 헹구고 헹구기 당 4개의 마이크로리터를 사용한다. 뉴클레오소성 조립 주식의 1마이크로리터를 여과된 뉴클레오소성 이미징 버퍼 250마이크로리터로 희석하여 1나노몰러의 최종 뉴클레오소성 농도를 한다.
표면에 이 희석제 2.5 마이크로리터를 보관하고 2분 동안 놓습니다. 포획을 피하기 위해 뉴클레오성 이미징 버퍼의 4 마이크로 리터로 표면을 두 번 헹구는다. 마지막 헹기 후에는 이미징 버퍼로 덮인 표면을 둡니다.
스캐너와 샘플을 팁 홀더 위에 올려 놓고 샘플이 아래로 향하도록 합니다. 접근 방식을 시작하려면 무료 진동 진폭에 가까운 세트 점 진폭으로 자동 접근 함수를 사용합니다. 서피스가 잘 추적될 때까지 세트점을 조정합니다.
그런 다음 이미징 프레임당 약 300밀리초의 데이터 수집 률로 약 150 x 150 나노미터에서 200 나노미터로 200 나노미터로 이미지 영역을 설정합니다. 조립 및 증착을 위한 제어로서, H3 단핵구는 정적 AFM을 사용하여 제조및 이미지화되었다. 이 이미지는 뉴클레오소모티드 집단의 스냅샷을 제공하며, 증착 직전에 존재하여 nucelosomes가 성공적으로 조립되었다는 것을 확인합니다.
H3 대조군 어셈블리가 성공하면, 제시된 방법은 CENP-A 뉴클레오좀의 연구에 다음에 적용되었다. 이 샘플의 정적 AFM 이미징은 어셈블리가 성공적이었다고 밝혔습니다. 정적 AFM 이미지에서 모노뉴클레오종의 높이와 회전 수를 특성화할 수 있습니다.
자유 DNA 무기와 자유 DNA 무기의 길이 사이의 각도는 모두 개별 뉴클레오종의 DNA 회전 수를 결정하는 데 사용됩니다. 대조적으로, 뉴클레오좀의 시간 경과 AFM 이미징은 뉴클레오좀의 전반적인 자발적인 포장 해제 거동을 시각화하는 데 사용될 수 있다. 뉴클레오종의 회전 수가 감소함에 따라 뉴클레오뉴매성 코어 부피의 상응하는 감소도 관찰된다.
일반 시간 경과 이미징 외에도, 고속 경과 AFM은 표준 시간 경과 이미징을 사용하여 놓친 더 복잡한 뉴클레오성 역학을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 능력은 1200프레임 동안 포획된 CENP-A 뉴클레오성 코어의 장거리 전좌를 시각화하는 데 필수적이었다. 이 기술은 또한 한 DNA 기판에서 다른 한 DNA 기판에서 CENP-A 뉴클레오소성 코어의 희소한 전송을 포착하는 데 중요했습니다.
빠른 이미지 캡처 속도는 이 동적 이벤트를 시각화할 수 있게 해주었으며, 이를 완료하는 데 몇 프레임만 걸렸습니다. 넓은 크로마틴 분야에서는 리거 히스톤의 역할과 크로마틴 역학의 히스톤 배율과 관련된 중요한 질문이 있습니다. 이 모든 질문은 우리의 기술을 사용하여 대답 할 수 있습니다.
