Este protocolo utiliza todas as principais características da AFM, não amenable a outras técnicas de molécula única. Como resultado, somos capazes de resolver a estrutura do nucleossomo em escala nano. É importante ressaltar que a visualização direta dos nucleosómos foi feita em condições fisiológicas.
Usando nossa técnica AFM, recentemente revelamos propriedades únicas do nucleossomo centrômero que podem desempenhar um papel na função de todo o centromere. O método a ser mostrado é atualmente aplicado em nosso laboratório para investigar a auto-montagem de proteínas associadas à formação de agregados amiloides. Esses agregados proteicos desencadeiam o desenvolvimento de doenças devastadoras como Alzheimer e Parkinson para citar alguns.
Os métodos simples de preparação também são aplicáveis a outros complexos de DNA proteico, incluindo grandes sistemas, como máquinas de replicação de DNA. Embora algumas modificações sejam necessárias. A fim de caracterizar partículas nucleossomos no nível de molécula única usando microscopia de força atômica estática e de lapso de tempo, comece por purificar, montar e validar os nucleossomos como descrito no protocolo de texto que acompanha.
Em seguida, prepare a superfície mica para imagens estáticas da AFM. Para isso, primeiro prepare uma solução de estoque APS de 50 milialares em água deionizada. Armazene uma alíquota mililitro desta solução a quatro graus Celsius, até que ela seja necessária.
A partir da solução de estoque, prepare uma solução APS de trabalho para modificação de mica, dissolvendo 50 microliters do estoque de 50 APS micromolar em 15 mililitros de água destilada desionizada. Misture a solução e, em seguida, encha uma cuvette com a solução. Em seguida, corte uma por três centímetros de tiras de mica de folhas de mica de alta qualidade.
Verifique se a peça se encaixa quando colocada diagonalmente em uma cuvette. Em seguida, corte camadas do mica até que ambos os lados estejam recém-cortados, e a peça é tão fina quanto 0,1 milímetro. Coloque imediatamente a peça mica no cuvette recheado aps e incubar o mica por 30 minutos.
Transfira a peça mica para uma cuvette cheia de água desomada e mergulhe-a por 30 segundos. Em seguida, use argônio para secar completamente ambos os lados da tira de mica APS. Aplique fita adesiva dupla face a vários discos magnéticos e coloque-os para o lado.
Em seguida, corte o substrato aps mica para um centímetro por quadrados de um centímetro, e cubra-os em uma placa de Petri limpa. Em seguida, prepare três diluições dos nucleosmos montados usando um tampão filtrado de 0,22 mícrono contendo 10 hepes milimilas e quatro cloreto de magnésio milimila em um PH de 7,5. Para limitar a perda de nucleosósmos, na baixa concentração final, a diluição deve ser feita uma de cada vez, imediatamente antes da deposição sobre o APS mica.
Deposite de 5 a 10 microlitadores de cada amostra nucleossomo no centro de uma peça de mica APS e deixe-os incubar por dois minutos. Em seguida, enxágue suavemente a amostra com dois a três mililitros de água destilada desotivada para remover os componentes tampão. E seque a amostra depositada sob um fluxo leve de argônio.
Para começar, monte uma ponta no suporte de ponta da configuração AFM. Em seguida, monte a primeira amostra no estágio AFM, tomando cuidado para não entrar em contato com a superfície da amostra. Posicione o laser sobre o cantilever até que sua soma esteja no máximo e ajuste os valores de deflexão vertical e lateral para perto de zero.
Em seguida, sintonize a sonda AFM para encontrar sua frequência ressonante, ajuste a amplitude da unidade e ajuste o tamanho da imagem para 100 por 100 nanômetros. Uma vez configurado, clique no botão engatar para iniciar a abordagem. Quando a abordagem estiver completa, otimize gradualmente o set point de amplitude até que a superfície da amostra seja claramente vista.
Em seguida, aumente o tamanho da varredura para um mícdente por um mícndo e a resolução para 512 por 512 pixels. Por fim, clique no botão de captura para iniciar a aquisição de imagens. Use cola do scanner de vara de vidro para fixar uma haste de vidro ao estágio do scanner AFM.
Deixe isso secar por um mínimo de 10 minutos. Enquanto isso, faça pedaços circulares de 0,1 milímetros de espessura de mica com um diâmetro de 1,5 milímetros, perfurando-os a partir de uma folha de mica maior. Use a cola da haste de vidro AFM mica de alta velocidade para fixar esta peça mica na haste de vidro na AFM de alta velocidade, e deixe-a permanecer intocada por um mínimo de 10 minutos enquanto seca.
Em seguida, aperte camadas do mica usando uma fita sensível à pressão até que uma camada bem cortada seja vista na fita. Em seguida, diluir um microliter de 50 mililitros de aps estoque em 99 microliters de água destilada desominada para fazer uma solução APS de 500 micromolar. Deposite 2,5 microliters da solução na superfície mica recém-cortada e deixe a superfície funcionalizar por 30 minutos.
Após a incubação, enxágue o mica várias vezes com água desorganizada, aplicando três microliters enxaguados. Remova a água completamente seguindo cada enxágue colocando um lenço não tecido na borda do mica. Após a lavagem final, coloque três microliters de água desorganizada desorganizada na superfície, e deixe descansar por um mínimo de cinco minutos para remover qualquer APS não especificamente vinculado.
Em seguida, coloque a sonda no suporte AFM de alta velocidade e posicione o suporte no estágio AFM com a ponta voltada para cima. Enxágüe o suporte utilizando 100 microliters de água desorganizada desorganizada, seguido por duas enxágües de 100 microliteres de 0,22 mícrons filtrados tampão de imagem nucleossom. Com as enxágües feitas, encha a câmara com 100 microliters de tampão de imagem nucleossomo, submergindo a ponta.
Ajuste a posição cantilever até que seja atingida com o laser. Em seguida, enxágue o APS mica cinco vezes com tampão de imagem nucleossome filtrado, usando quatro microliters por enxágue. Diluir um microliter do estoque de montagem nucleossomo em 250 microliters de tampão de imagem nucleossom filtrado para uma concentração nucleossomo final de um nanomolar.
Deposite 2,5 microliters desta diluição na superfície e deixe descansar por dois minutos. Enxágüe a superfície duas vezes com quatro microliters de tampão de imagem nucleossomo para evitar sobre aglomeração. Após a lavagem final, deixe a superfície coberta de tampão de imagem.
Coloque o scanner e a amostra em cima do suporte da ponta para que a amostra fique de bruça. Para iniciar a abordagem, use a função de aproximação automática com a amplitude do set point perto da amplitude de oscilação livre. Ajuste o ponto de ajuste até que a superfície esteja sendo bem rastreada.
Em seguida, defina a área de imagem em torno de 150 por 150 nanômetros para 200 por 200 nanômetros com a taxa de aquisição de dados de cerca de 300 milissegundos por quadro de imagem. Como controle para a montagem e deposição, mononucleosmos H3 foram preparados e imagens usando AFM estática. Esta imagem fornece um instantâneo da população nucleossomo como existia momentos antes do depoimento confirmando que os nucelosmos foram montados com sucesso.
Com a montagem de controle H3 um sucesso, os métodos apresentados foram aplicados em seguida ao estudo dos nucleosmos cenp-a. Imagens estáticas da AFM desta amostra revelaram que sua montagem foi um sucesso. A partir das imagens estáticas da AFM, o número de altura e giro de mononucleosmos poderia ser caracterizado.
Tanto o ângulo entre os braços de DNA livres quanto o comprimento dos braços de DNA livres são usados para determinar o número de voltas de DNA no nucleossomo individual. Em contraste, a imagem afm do lapso de tempo dos nucleosmosos pode ser usada para visualizar o comportamento espontâneo geral dos nucleosmos. À medida que o número de turnos do nucleossomo diminui, também é observada uma diminuição correspondente no volume do núcleo nucleossomo.
Além da imagem regular de lapso de tempo, o AFM de lapso de tempo de alta velocidade pode ser usado para sondar a dinâmica nucleossomo mais complexa que é perdida usando imagens padrão de lapso de tempo. A capacidade dessa técnica de capturar a dinâmica durante um longo período de tempo foi essencial para a visualização de uma translocação de longa distância de um núcleo nucleossomo CENP-A, que foi capturado ao longo de 1200 quadros. Esta técnica também foi fundamental na captura da rara transferência de um núcleo nucleossomo CENP-A de um substrato de DNA para outro.
A rápida taxa de captura de imagem tornou possível a visualização desse evento dinâmico, pois foram necessários apenas vários quadros para ser concluído. No amplo campo da cromatina há um conjunto de questões importantes relacionadas aos papéis de histones liger e ampliação de histona da dinâmica cromatina. Todas essas perguntas podem ser respondidas usando nossa técnica.
