이 방법은 면역 물질 대사 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 장점은 다른 세포 유형의 복잡한 혼합물에서 개별 살아있는 세포에서 미토콘드리아 또는 리소좀의 정량화를 허용한다는 것입니다. T 및 B 세포를 연구하기 위한 이 방법은 또한 대식세포, 수지상 세포, 또는 조직 견본에서 수확된 어떤 1 차적인 세포와 같은 많은 그밖 세포 모형에 적용될 수 있습니다.
절차는 내 실험실에서 대학원생 인 친 웬 웨이에 의해 입증될 것입니다. 양자화를 위해 세포기관에 라벨을 붙이려면 먼저 마커당 1라운드 하단 팩스 튜브에 여섯 번째 마우스 T 셀에 1회 10번 을 추가합니다. 그리고 원심 분리에 의해 세포를 펠렛.
세포특정 프로브 스톡 솔루션을 중간크기의 최종 작업 농도로 희석하기 위해 37°C까지 미리 따뜻해져 있다. 그리고 튜브 당 프로브 염료의 100 마이크로 리터에서 세포를 다시 중단합니다. 다음으로, 적절한 염색 기간 동안 세포 배양 인큐베이터에서 세포를 배양하고, 튜브 당 얼음 냉간 팩스 버퍼1밀리리터로 인큐베이션의 끝에서 반응을 중지한다.
이어서, 또 다른 원심분리로 세포를 수집하고 얼음위에 미리 정된 24G2 hybridoma 상수제의 100마이크로리터에서 펠릿을 다시 중단한다. 10분 후 튜브당 팩스 버퍼 1밀리리터를 추가합니다. 원심분리에 의해 세포를 수집하고 사전 조정된 형광의 50 마이크로리터로 세포를 라벨로 지정하여 관심 있는 항체 칵테일을 접수합니다.
테이블에 따라 적절한 농도를 추가합니다. 그리고 빛으로부터 보호 얼음에 20 분 동안 버퍼링합니다. 인큐베이션이 끝나면 튜브당 팩스 버퍼 1밀리리터를 추가합니다.
원심 분리에 의해 세포를 수집합니다. 그리고 프로피듐 요오드의 밀리리터 당 하나의 마이크로그램으로 보충 팩스 버퍼의 300 마이크로 리터에서 세포를 다시 중단. 핵 및 염색체 카운터스테인을 추가한 직후 기계 플랫폼에 따라 유동 세포계 분석 컴퓨터, 흐름 사이토미터, 팩스 획득 소프트웨어 및 기타 액세서리 장치를 켭니다.
유동선이 PBS 및 시어테 버퍼로 채워지도록 시스템을 통해 PBS를 약 1분 동안 실행합니다. 새로운 실험을 열고 제조업체의 지침에 따라 사이토미터 매개 변수를 설정합니다. 70 마이크로미터 세포 여과기를 통해 세포를 필터링합니다.
그리고 덩어리와 이중 형성을 피하기 위해 각 샘플의 취득 전에 소용돌이. 자동 보정 설정을 열고 각 형광 매개변수에 대한 점 플롯을 만듭니다. 모든 전압이 설정된 후 보정을 조정하고 보정을 샘플에 적용합니다.
측면 분산 플롯과 전방 분산을 만들고 전압을 최적화하여 관심 있는 셀이 플롯 내에 표시되도록 합니다. 앞으로 분산된 높이 플롯과 방향 분산을 만들고 단일 셀을 게이트합니다. 측면 분산 영역 플롯과 림프구의 게이트에 대한 전방 분산 영역을 만듭니다.
프로피듐 요오드 플롯대 전방 분산 영역을 만들고 라이브 셀을 게이트합니다. 모든 전압이 설정된 후 보정을 조정하고 보정을 샘플에 적용합니다. 그런 다음 첫 번째 샘플 튜브를 로드하고, 적절한 세포 표면 마커 플롯을 만들고, 관심 있는 집단의 적어도 1, 000 이벤트를 수집한다.
모든 샘플을 실행한 경우 후속 분석을 위해 흐름 데이터를 내보냅니다. 그리고 미래에 유사한 실험에 대한 사이토미터 설정 및 매개 변수를 보존하기 위해 실험을 템플릿으로 저장합니다. 최종 부위 미토콘드리아 함량은 이중 음수 1T 세포에서 가장 낮으며, 이중 음수 단계 2및 3에서 피크를 기록하며, 이중 음수 단계 4에서 약간 감소합니다.
CD4 및 CD8 단일 양성 티모세포보다 더 많은 수의 미토콘드리아를 보여주는 이중 양성 티모사이클로 개발 중에 미토콘드리아 함량이 변동한다는 것을 시사합니다. CD4 및 CD8 단일 양성 티모세포는 비장 CD4 또는 CD8 T 세포보다 더 높은 미토콘드리아 평균 형광 강도를 나타내며, 산소가 풍부한 혈액 환경에서 재순환하는 순진한 T 세포가 티모세포보다 훨씬 낮은 미토콘드리아 질량을 가지고 있음을 시사한다. 흥미롭게도, 미토콘드리아 내용의 이러한 감소는 CD4 T 세포 계보보다 CD8에서 더 두드러지며, T 세포 활성화는 이들 세포세포의 존재를 더욱 감소시다.
비교적 낮지만 검출 가능한 리소소말 함량은 모든 티모사이클 집단에서 관찰되며, 이중 음수 1개의 티모사이클에서 더 두드러진 존재가 있습니다. 주변에서, 상대적으로 많은 수의 리소좀이 메모리 및 이펙터 CD8 양성 T 세포에서 검출된다. 유기체 특이적 염료와 표면 마커를 유동 세포측정과 결합하는 것은 복잡한 혼합물에서 세포의 대사 상태를 특성화하는 강력한 방법입니다.
추가 소세포 특이적 염료는 내피성 망상, 자가형성 바쿠올 또는 기타 세포내 구획을 검출하는 데 사용될 수 있다.
