Этот метод может помочь нам ответить на ключевые вопросы в области иммуно-метаболизма. Преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет количественно определить митохондрии или лизосомы в отдельных живых клетках, в сложной смеси различных типов клеток. Этот метод для изучения Т и В клеток также может быть применен ко многим другим типам клеток, таких как макрофаги, дендритные клетки, или любые первичные клетки, собранные из образца ткани.
Процедуру продемонстрирует Чин-Вэнь Вэй, аспирант моей лаборатории. Чтобы маркировать органеллы для количественной оценки, во-первых, добавьте один раз десять к шестой Т-клеток мыши к одной круглой нижней трубке факса на маркер. И гранулировать клетки центрифугой.
предварительно разогретый до 37 градусов по Цельсию сыворотки свободной культуры среды разбавить органеллы конкретных растворов зонда запасов для окончательной рабочей концентрации в среде. И повторно приостановить клетки в 100 микролитров зонд красителя на трубку. Далее, инкубировать клетки в инкубаторе культуры клеток для соответствующего периода окрашивания, останавливая реакцию в конце инкубации с одним миллилитром ледяного буфера факса на трубку.
Затем соберите клетки с другой центрифугации и повторно приостановить гранулы в 100 микролитров предварительно титрованные 24G2 гибридомы супернатант на льду. Через десять минут добавьте один миллилитр буфера факса на трубку. Соберите клетки центрифугации и этикетки клеток с 50 микролитров предварительно титрованные флуоресценции конъюгированных антител коктейль интерес.
Добавьте соответствующую концентрацию в соответствии с таблицей. И факс буфер в течение 20 минут на льду, защищенный от света. В конце инкубации добавьте один миллилитр буфера факса на трубку.
Соберите клетки путем центрифугации. И повторно приостановить клетки в 300 микролитров буфера факса дополняется одним микрограммом на миллилитр иодида пропидия. Сразу же после добавления ядерного и хромосомного счетчика включите компьютер цитометрического анализа потока, цитометр потока, программное обеспечение для приобретения факсов и любые другие аксессуары в зависимости от платформы машины.
Запуск PBS через систему в течение примерно одной минуты, чтобы убедиться, что поток линии заполнены PBS и sheathe буфера. Откройте новый эксперимент и установите параметры цитометра в соответствии с инструкциями производителя. Фильтр клетки через 70 микрометровый ситечко клетки.
И вихрь до приобретения каждого образца, чтобы избежать комков и двойного образования. Откройте параметр автоматической компенсации и создайте точечные участки для каждого флуоресцентного параметра. После того, как все напряжения были установлены, отрегулируйте компенсацию и примените компенсацию к образцам.
Создайте форвардный рассеяние по сравнению с боковым рассеянием участка и оптимизируйте напряжение, чтобы ячейки, представляющие интерес, появлялись в сюжете. Создайте вперед рассеяния по сравнению с вперед рассеяния высота участка и ворота одного ячейки. Создайте вперед рассеяния области по сравнению с боковой области рассеяния участка и ворота лимфоцитов.
Создайте перемотка вперед области по сравнению с пропидия йодида участок и ворота живых клеток. После того, как все напряжения были установлены, отрегулируйте компенсацию и примените компенсацию к образцам. Затем загрузите первую пробную трубку, создайте соответствующие участки маркера поверхности клетки и соберите не менее 1000 событий населения, представляющих интерес.
Когда все образцы будут запущены, экспортите данные потока для последующего анализа. И сохранить эксперимент в качестве шаблона для сохранения параметров цитометра и параметров для подобных экспериментов в будущем. Окончательное митохондриальное содержимое сайта является самым низким в двойном отрицательном одной Т-клеток, пик на двойной отрицательной стадии два и три, и незначительное снижение в двойном отрицательном этапе четыре.
С двойными положительными тимоцитами, демонстрирующими большее количество митохондрий, чем CD4 и CD8 одиночных положительных тимоцитов, что свидетельствует о том, что митохондриальное содержание колеблется во время развития. CD4 и CD8 одиночные положительные тимоциты exhibit более высокая митохондриальная средняя интенсивность флуоресценции чем splenic CD4 или CD8 T клетки, предлагая что наивные Т-клетки которые recirculate в окружающей среде крови кислорода богатые люди имеют даже более низкую митохондриальную массу чем тимоциты. Интересно, что это сокращение митохондриального содержания является более заметным в CD8, чем CD4 T клеточной линии, и активация Т-клеток еще больше уменьшает присутствие этих органелл.
Относительно низкое, но обнаруживаемое лизосомальное содержание наблюдается во всех популяциях тимоцитов, при этом более заметное присутствие в двойном отрицательном тимоцитах. На периферии относительно большое количество лизосом обнаруживается в памяти и эффекторе CD8 положительных Т-клеток. Сочетание органеллы конкретных красителей и поверхностного маркера с цитометрией потока является мощным способом характеристики метаболического состояния клеток в сложной смеси.
Дополнительный органель специфический краситель может быть использован для обнаружения эндоплазмической ритикулум, аутофагический вакуол, или другой внутриклеточный отсек интереса.
