La función mitocondrial es fundamental para la autoexaprobación de células madre hematopoyéticas. La actividad mitocondrial es un reflector del potencial interno de la membrana mitocondrial, que puede medirse mediante TMRM, un colorante catiónico fluorescente celular y permeante. Las bombas de eflujo xenobiótico son altamente activas en HSC y causan extrusión TMRM.
La principal ventaja de este protocolo, es la corrección de este efecto, utilizando Verapamil, un inhibidor de las bombas de eflujo. Comience por aislar la médula ósea de los fémures de ratón. Usa un par de fórceps y tijeras afiladas para cortar las dos patas posteriores.
Luego haz un pequeño recorte en la piel ventral del ratón, y estírala. Extraiga el fémur y la tibia, teniendo cuidado de no desalojar las cabezas del fémur, y coloque los huesos en una placa de seis pozos, llena de 1,5 mililitros de tampón de tinción. Retire los músculos de los huesos y corte los extremos de los huesos, permitiendo que la médula ósea salga.
Coloque los huesos limpios en pozos nuevos, con 1,5 mililitros de tampón de tinción. Luego, enjuague la médula ósea con una jeringa de tres mililitros y una aguja de calibre 25, hasta que el hueso se vuelva blanco. Recoger todas las células en un tubo de 1,5 mililitros, y centrifugarlas durante cinco minutos a 180 veces G, luego deseche el sobrenadante.
Resuspender cuidadosamente el pellet en 300 microlitros de tampón de colorante ACK helado, y poner las células en hielo durante un minuto. A continuación, desactive inmediatamente la lysis añadiendo un mililitro de tampón de tinción. Centrifugar las células durante cinco minutos a 180 veces G.Resuspend el pellet celular, que debe aparecer blanco, en un mililitro de tampón de tinción.
Filtrar las células utilizando una tapa de colador celular, con una malla de nylon de 35 micrómetros, para obtener células mononucleares. Comience preparando el cóctel de linaje y anticuerpos conjugados con fluoróforos, de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Mantenga los anticuerpos sobre hielo y protegidos de la luz.
Luego, centrifuga la muestra durante cinco minutos a 180 veces G, y deseche el sobrenadante. Añadir 400 microlitros del cóctel de linaje, y cuatro microlitros de anticuerpos biotinilados CD135 al pellet celular, y vórtice la mezcla. Luego incubarlo sobre hielo durante 30 minutos.
Después de la incubación, lave la muestra añadiendo tres mililitros de tampón de tinción, girando hacia abajo durante cinco minutos a 180 veces G, y descartando el sobrenadante. A continuación, agregue 400 microlitros de solución de anticuerpos y vórtice la mezcla. Incubarlo sobre hielo durante otros 30 minutos, y repetir el lavado con el tampón de tinción.
Para preparar la solución de tinción TMRM, agregue 2,2 microlitros de solución de material TMRM, y 1,1 microlitros de Verapamil, a 1,1 mililitros de medio de cultivo hematopoyético sin suero, con trombopoyetina y factor de células madre. Resuspender la médula ósea en un mililitro de la solución de tinción TMRM, vórtice rápidamente e incubar durante una hora a 37 grados centígrados. Filtre la muestra con una tapa de colador celular, con una malla de nylon de 35 micrómetros, para evitar obstruir el citómetro de flujo.
A continuación, agregue un microlitro de DAPI y proceda con la citometría de flujo. Ejecuta la muestra de médula ósea y adquiere al menos un millón de eventos. A continuación, muestre las células mononucleares de médula ósea viva en una gráfica para el azul pacífico, para identificar fracciones CD135 Lin-negativas y Lin-positivas.
Trazar la fracción Lin-negativa para APC/Cy7 frente a PE/Cy7 para identificar el progenitor multipotente o la fracción MPP. A continuación, trace la fracción MPP para APC frente a PerCP/Cy5.5, para identificar la célula madre hematopoyética o la fracción HSC. Visualice la fracción HSC para FITC, o CD34, para dividirla en fracciones HSC negativas CD34 y HSC positivas CD34.
Finalmente adquirir la intensidad TMRM en cada población. Para asegurarse de que la tinción TMRM funcionó correctamente, agregue un microlitro de FCCP a la muestra, para una concentración final de un milimolar, e incubarlo a 37 grados centígrados durante cinco minutos. Luego adquiere un millón de eventos.
Después de la adición de FCCP, la intensidad TMRM debe aumentarse drásticamente. Este protocolo se ha utilizado con éxito para cuantificar el potencial de la membrana mitocondrial en varias poblaciones celulares, con tinte TMRM. Se ha demostrado que la presencia de PBS y FBS en el medio de cultivo afecta a la intensidad de la señal TMRM.
Por lo tanto, es importante realizar la tinción TMRM en un medio de expansión sin suero. Las células madre hematopoyéticas expresan altos niveles de actividad de bombas de eflujo xenobiótico que extruyen el tinte TMRM. Así que los perfiles TMRM también varían en presencia de Verapamil o Ciclosporina H, que bloquean las bombas.
Para verificar la exactitud de la tinción TMRM, FCCP puede ser despolarizar las mitocondrias, y reducir la intensidad TMRM. Este protocolo se puede adaptar fácilmente para estudiar HSC con un tinte potencial de membrana mitocondrial diferente, incluyendo TMRE o JC-1. Así como otros tintes mitocondriales como MitoTracker o MitoSOX.
Los problemas críticos heredados por la diferente actividad de las bombas de eflujo entre la población de médula ósea se señalaron recientemente. Por lo tanto, este protocolo tiene como objetivo reducir la discrepancia entre los hallazgos anteriores.
