Este protocolo aborda la reproducibilidad de lote a lote de nanopartículas de sulfonato y oro anfifílico que nuestro laboratorio utiliza en experimentos con células, virus y proteínas. Esta técnica aborda los contaminantes inorgánicos comunes a este tipo de síntesis. También introduce controles y equilibrios después de cada paso para garantizar la reproducibilidad de las nanopartículas de oro anfifílico.
Esta técnica es laboriosa y requiere paciencia. El nivel de dificultad depende de la escala, así que comience a pequeña escala y familiarícese con cada instrumento y paso antes de escalar verticalmente. En primer lugar, agregue 11-bromo-1-undeceno, sulfito sódico y bromuro de bencimetillammonio a 200 mililitros de metanol y 450 mililitros de agua desionizada, en un matraz de fondo redondo de un litro.
Reflujo la mezcla de reacción a 102 grados centígrados durante 48 horas hasta que la solución se vuelva incolora. Después del trabajo, suspender el polvo blanco aislado en 400 mililitros de metanol en un matraz inferior redondo. Con un matraz filtrante y un filtro de borosilicato, filtre la solución para eliminar los subproductos inorgánicos insolubles de metanol.
A continuación, disolver aproximadamente 30 gramos de undec-10-enesulfonato de sodio en 500 mililitros de metanol, en un matraz de fondo redondo de un litro. Añadir 2,6 veces el exceso de ácido tioacético a la solución, y revuelva delante de una lámpara UV de 250 vatios durante la noche. Una vez completada la reacción, evapore el metanol por completo.
Seque el polvo al vacío y disperse en éter dietílico. Filtrar la mezcla y lavar el producto sólido con éter dietílico para eliminar cualquier exceso de ácido tioacético hasta que no aparezcan más sustancias de color en el sobrenadante de éter dietílico. Después de secar el sólido bajo alto vacío, disolverlo en metanol, produciendo una solución de amarillo a naranja.
A continuación, añadir tres gramos de negro de carbono a la solución y mezclar vigorosamente. A continuación, filtre la mezcla a través de Celite, cubriendo 2/3 de un papel de filtro estriado. Para sintetizar MUS, combine aproximadamente 400 mililitros de un ácido clorhídrico molar y 35 gramos de sodio 11-acetiltio-undecanesulfonato en un matraz de fondo redondo de un litro.
Reflujo la mezcla a 102 grados Celsius durante 12 horas para cortar el grupo de tioacetato y obtener un tiol. Al día siguiente, transfiera el producto a un matraz de fondo redondo de dos litros. Para mantener la solución ácida y evitar la cristalización de sales inorgánicas, agregue 200 mililitros de un hidróxido de sodio molar y 400 mililitros de agua desionizada al matraz para dar un volumen final de un litro.
Almacene la solución transparente a cuatro grados centígrados durante la noche para cristalizar el producto como sólidos finos que son viscosos cuando están mojados. Al día siguiente, decantar el sobrenadante transparente. A continuación, transfiera el producto a tubos centrífugos de 50 mililitros y centrífuga durante cinco minutos a 4000 g.
Después de la centrifugación, decantar el sobrenadante en otro matraz inferior redondo. Transfiera los pellets blancos a tubos centrífugos y seque bajo alto vacío para obtener MUS soluble en metanol en aproximadamente 30% de rendimiento. Pesar 177,2 miligramos de oro (III) cloruro trihidrato en un pequeño vial de vidrio.
Después de esto, disolver 87 miligramos de MUS en 10 mililitros de metanol, en un vial de vidrio de 20 mililitros. Sonicar la solución en un baño ultrasónico hasta que no se ve ningún material sólido, para asegurar la disolución completa. Añadir 26 microlitros de 1-Octanethiol a la solución de metanol, y agitarlo para mezclar los ligandos.
Añadir 500 miligramos de borohidruro de sodio a 100 mililitros de etanol en un matraz inferior redondo de 250 mililitros. Revuelva vigorosamente hasta que la solución esté clara. Disolver la sal de oro en 100 mililitros de etanol en un matraz inferior redondo de 500 mililitros y remover a 800 RPM hasta que la sal de oro se disuelva por completo.
A continuación, añada la solución de ligando a la mezcla de reacción. Espere 15 minutos para la formación del complejo dorado-tiolado, que se indica mediante un cambio de color de amarillo translúcido a amarillo turbio. Agregue la solución de borohidruro de sodio previamente preparada a la mezcla de reacción, utilizando un embudo separador.
Ajuste el tiempo de intervalo de las gotas para que la adición de borohidruro de sodio tarde aproximadamente una hora. Una vez completada la adición de borohidruro de sodio, retire el embudo de adición y deje que la mezcla de reacción se revuelva durante otra hora. A continuación, retire la barra de agitación magnética con un imán colocado en el exterior del matraz inferior redondo.
Almacene la mezcla de reacción a cuatro grados centígrados durante la noche para precipitar las nanopartículas. Después de decantar el etanol sobrenadante, transfiera el precipitante restante a tubos de centrífuga de 50 mililitros y centrífuga durante tres minutos a 4000 veces g. Después de la centrifugación, decantar el sobrenadante.
Dispersar las nanopartículas de nuevo con etanol por vórtice. Luego, centrifugar las muestras de nuevo. Seque las nanopartículas al vacío para eliminar el etanol residual.
Para limpiar las nanopartículas de ligandos hidrófilos libres, disolver los precipitados en 15 mililitros de agua desionizada, y transferir las soluciones a tubos centrífugos con membranas de filtración de 30 kilodalton de peso molecular de corte. Concentrar las soluciones de nanopartículas por centrifugación durante cinco minutos a 4000 veces g. Después de la centrifugación, añadir 15 mililitros de agua desionizada, y centrífuga para concentrarse de nuevo.
Para convertir las nanopartículas en un polvo manejable, seque la solución acuosa restante. Para caracterizar las nanopartículas por relación con ligandos, prepare una solución de 150 miligramos por mililitro de metanol-d4 de yodo. Añadir 600 microlitros de la solución a aproximadamente cinco miligramos de nanopartículas en un vial de vidrio para grabar las nanopartículas.
Envuelva la tapa del vial con película de parafina y sonicércelo en un baño ultrasónico durante 20 minutos. A continuación, transfiera la solución a un tubo de RMN y adquiera un espectro de RMN de protones con 32 escaneos. La síntesis MUS se muestra aquí.
Los espectros de RMN de protones del producto de cada paso se representan aquí. El flujo de trabajo de síntesis de las nanopartículas binarias de oro anfifílico MUS Octanethiol se describe aquí. Antes de la caracterización, la limpieza de las nanopartículas de ligandos libres sin enlazar fue monitoreada por la RMN de protones.
La distribución del tamaño de las nanopartículas se caracterizó por TEM, lo que muestra que el diámetro medio es de 2,4 nanómetros que apuntan a aproximadamente 18,08 nanómetros cuadrados de superficie, y 7,23 nanómetros en cubos de volumen por partícula. La absorción localizada del plasma superficial y la resonancia se midió mediante la adquisición de espectros UV-vis. Aquí se muestran espectros representativos de RMN de protones con asignaciones máximas e integración para determinar la relación de ligandos en las nanopartículas grabadas en yodo.
El espectro de RMN de las nanopartículas mostró que la relación de MUS a Octanethiol es de 85 a 15. La cobertura superficial de las nanopartículas fue examinada por TGA. Según los datos de TGA, la densidad del ligando puede estimarse en 4,8 ligandos por nanómetro cuadrado.
Las relaciones estequiométricas frente a las relaciones de RMN de Octanethiol resultantes de varias síntesis se comparan aquí. Las cosas más importantes a recordar en este procedimiento son, por un lado, la eliminación de impurezas inorgánicas mientras se preparan los ligandos MUS, y por el otro lado, el estudio de las nanopartículas. Este procedimiento es susceptible de varias combinaciones de ligandos, pero asegúrese de caracterizar siempre cada lote individualmente.
Una pregunta que este procedimiento puede responder, por ejemplo, es hasta qué punto la relación de ligando corresponde a la estequiometría que se encuentra en la superficie de las nanopartículas. La ampliación de la producción del ligando y la demostración de la reproducibilidad de lote a lote de las nanopartículas, nos ha permitido abordar cuestiones importantes relacionadas con la biología y la medicina. Por ejemplo, hemos establecido las propiedades virucidas de estas nanopartículas.
Por favor, trabaje cuidadosamente cuando utilice la lámpara UV, y use siempre guantes protectores cuando manipule nitrógeno líquido. Siga siempre las normas de seguridad química.
