Questo protocollo affronta la riproducibilità batch-to-batch delle nanoparticelle d'oro sulfonate e anfifile che il nostro laboratorio utilizza negli esperimenti con cellule, virus e proteine. Questa tecnica affronta i contaminanti inorganici comuni a questo tipo di sintesi. Introduce anche controlli ed equilibri dopo ogni fase per garantire la riproducibilità delle nanoparticelle d'oro anfifiliche.
Questa tecnica è laboriosa e richiede pazienza. Il livello di difficoltà dipende dalla scala, quindi inizia su piccola scala e familiarizza con ogni strumento e passo prima di scalare. In primo luogo, aggiungere 11-bromo-1-undecene, solfito di sodio e bromuro di benziltrietilammonio a 200 millilitri di metanolo e 450 millilitri di acqua deionizzata, in un pallone di fondo rotondo da un litro.
Reflusso della miscela di reazione a 102 gradi Celsius per 48 ore fino a quando la soluzione diventa incolore. Dopo il lavoro, sospendere la polvere bianca isolata in 400 millilitri di metanolo in un pallone inferiore rotondo. Utilizzando un pallone filtrante e un filtro borosilicato, filtrare la soluzione per rimuovere i sottoprodotti inorganici insolubili al metanolo.
Successivamente, sciogliere circa 30 grammi di sodio undec-10-enesulfonato in 500 millilitri di metanolo, in un pallone inferiore rotondo da un litro. Aggiungere 2,6 volte l'eccesso di acido tioacetico alla soluzione e mescolarlo davanti a una lampada UV da 250 watt durante la notte. Una volta completata la reazione, evaporare completamente il metanolo.
Asciugare la polvere sotto vuoto, quindi disperderla nell'etere dietile. Filtrare la miscela e lavare il prodotto solido con etere dietile per rimuovere l'acido tioacetico in eccesso fino a quando non compaiono più sostanze colorate nel supernatante dell'etere dietile. Dopo aver asciugato il solido sotto alto vuoto, sciogliere in metanolo, producendo una soluzione da gialla a arancione.
Successivamente, aggiungere tre grammi di nero fumo alla soluzione e mescolare vigorosamente. Quindi, filtrare la miscela attraverso Celite, coprendo 2/3 di una carta filtrante scanalata. Per sintetizzare MUS, combinare circa 400 millilitri di un acido cloridrico molare e 35 grammi di sodio 11-acetiltio-undecanesulfonato in un pallone dal fondo rotondo da un litro.
Reflusso la miscela a 102 gradi Celsius per 12 ore per scindere il gruppo tioacetato e ottenere un tiolo. Il giorno seguente, trasferire il prodotto in un pallone inferiore rotondo da due litri. Per mantenere acida la soluzione e prevenire la cristallizzazione di sali inorganici, aggiungere 200 millilitri di un idrossido di sodio molare e 400 millilitri di acqua deionizzata al pallone per dare un volume finale di un litro.
Conservare la soluzione chiara a quattro gradi Celsius durante la notte per cristallizzare il prodotto come solidi fini viscosi quando bagnati. Il giorno seguente, decantare il chiaro supernatante. Quindi, trasferire il prodotto in tubi di centrifuga da 50 millilitri e centrifugare per cinque minuti a 4000 volte g.
Dopo la centrifugazione, decantare il supernatante in un altro pallone inferiore rotondo. Trasferire i pellet bianchi in tubi di centrifuga e asciugare sotto vuoto elevato per ottenere MUS solubile in metanolo in una resa di circa il 30%. Pesare 177,2 milligrammi di cloruro d'oro(III)triidrato in una piccola fiala di vetro.
In seguito, sciogliere 87 milligrammi di MUS in 10 millilitri di metanolo, in una fiala di vetro da 20 millilitri. Sonicare la soluzione in un bagno ad ultrasuoni fino a quando non è visibile alcun materiale solido, per garantire la completa dissoluzione. Aggiungere 26 microlitri di 1-ottanetiolo alla soluzione di metanolo e agitarlo per mescolare i ligandi.
Aggiungere 500 milligrammi di boroidro di sodio a 100 millilitri di etanolo in un pallone inferiore rotondo da 250 millilitri. Mescolare vigorosamente fino a quando la soluzione non è chiara. Sciogliere il sale d'oro in 100 millilitri di etanolo in un pallone inferiore rotondo da 500 millilitri e mescolare a 800 giri/min fino a quando il sale d'oro non si dissolve completamente.
Quindi, aggiungere la soluzione di ligando alla miscela di reazione. Attendere 15 minuti per la formazione del complesso oro-tiolato, che è indicato da un cambio di colore dal giallo traslucido al giallo torbido. Aggiungere la soluzione di boroidro di sodio precedentemente preparata per quanto riguarda la goccia alla miscela di reazione, utilizzando un imbuto separatore.
Regolare il tempo di intervallo delle gocce in modo che l'aggiunta di boroidro di sodio richiede circa un'ora. Una volta completata l'aggiunta di boroidro di sodio, rimuovere l'imbuto di addizione e lasciare mescolare la miscela di reazione per un'altra ora. Quindi, rimuovere la barra di agitazione magnetica utilizzando un magnete posizionato all'esterno del pallone inferiore rotondo.
Conservare la miscela di reazione a quattro gradi Celsius durante la notte per far precipitare le nanoparticelle. Dopo aver decantato l'etanolo supernatante, trasferire il precipitante rimanente a tubi di centrifuga da 50 millilitri e centrifugare per tre minuti a 4000 volte g. Dopo la centrifugazione, decantare il supernatante.
Disperdere di nuovo le nanoparticelle con l'etanolo con il vortice. Quindi, centrifuga di nuovo i campioni. Asciugare le nanoparticelle sotto vuoto per rimuovere l'etanolo residuo.
Per pulire le nanoparticelle dai ligandi idrofili liberi, sciogliere i precipitati in 15 millilitri di acqua deionizzata e trasferire le soluzioni a tubi di centrifuga con membrane di filtrazione di 30 kilodalton tagliano il peso molecolare. Concentrare le soluzioni di nanoparticelle mediante centrifugazione per cinque minuti a 4000 volte g. Dopo la centrifugazione, aggiungere 15 millilitri di acqua deionizzata e centrifugare per concentrarsi di nuovo.
Per trasformare le nanoparticelle in una polvere gestibile, congelare la soluzione acquosa rimanente. Per caratterizzare le nanoparticelle per rapporto ligando, preparare una soluzione di iodio da 150 milligrammi per millilitro metanolo-d4. Aggiungere 600 microlitri della soluzione a circa cinque milligrammi di nanoparticelle in una fiala di vetro per incidere le nanoparticelle.
Avvolgere il cappuccio della fiala con pellicola di paraffina e sonicarlo in un bagno ad ultrasuoni per 20 minuti. Quindi, trasferire la soluzione su un tubo NMR e acquisire uno spettro NMR protonico con 32 scansioni. La sintesi MUS è mostrata qui.
Qui sono rappresentati gli spettri NMR protoni del prodotto di ogni passo. Il flusso di lavoro di sintesi delle nanoparticelle d'oro anfifile mus ottanetiolo binarie è descritto qui. Prima della caratterizzazione, la pulizia delle nanoparticelle dai ligandi liberi non vincolati era monitorata dal protone NMR.
La distribuzione delle dimensioni delle nanoparticelle è stata caratterizzata da TEM, che mostra che il diametro medio è di 2,4 nanometri che puntano a circa 18,08 nanometri quadrati di superficie e 7,23 nanometri a cubetti di volume per particella. Il plasma superficiale localizzato e l'assorbimento della risonanza sono stati misurati acquisendo spettri UV-vis. Qui sono mostrati spettri nmr protoni rappresentativi con assegnazioni di picco e integrazione per determinare il rapporto ligando nelle nanoparticelle incise allo iodio.
Lo spettro NMR delle nanoparticelle ha mostrato che il rapporto tra MUS e ottanetiolo è da 85 a 15. La copertura superficiale delle nanoparticelle è stata esaminata dalla TGA. Sulla base dei dati TGA, la densità del ligando può essere stimata in 4,8 ligandi per nanometro al quadrato.
Qui vengono confrontati i rapporti stechiometrici rispetto ai rapporti NMR di ottanetiolo risultanti da varie sintesi. Le cose più importanti da ricordare in questa procedura sono, da un lato, la rimozione delle impurità inorganiche durante la preparazione dei ligandi MUS e, dall'altro, il lavoro delle nanoparticelle. Questa procedura è suscettibile a varie combinazioni di ligandi, ma assicurati di caratterizzare sempre ogni lotto individualmente.
Una domanda a cui questa procedura può rispondere, ad esempio, è in che misura il rapporto ligando corrisponde alla stechiometria trovata sulla superficie delle nanoparticelle. Aumentare la produzione del ligando e dimostrare la riproducibilità lotto per lotto delle nanoparticelle, ci ha permesso di affrontare importanti questioni legate alla biologia e alla medicina. Per esempio, abbiamo stabilito le proprietà virucide di queste nanoparticelle.
Si prega di lavorare con attenzione quando si utilizza la lampada UV e indossare sempre guanti protettivi quando si maneggia azoto liquido. Seguire sempre le regole di sicurezza chimica.
