Este protocolo proporciona un sistema económico y adaptable para evaluar la dinámica temporal de las señales fluoroquímicas en colletotrichum fiorniae y otros patógenos vegetales que infectan la floración a término. Los nuevos dispositivos de recolección de agua de lluvia en suelo permiten al usuario monitorear estimulantes naturales y condiciones que afectan el desarrollo de patógenos de una manera casi específica del sitio en tiempo real. Comience este procedimiento con una cultura de Colletotrichum fiorniae de un huésped infectado naturalmente como se describe en el protocolo de texto.
Cuando las colonias comienzan a esporular, raya la conidia sobre otro agar V 8 Juice que contiene un plato de cultivo celular para producir un cultivo esporulante de alta densidad. Después de siete días de crecimiento, utilice un bucle estéril estándar para reunir una pequeña cantidad de conidia de la cultura de alta densidad tocando ligeramente el bucle a la masa conidial. Revuelva esto en un tubo centrífuga de 15 mililitros que contenga 10 mililitros de agua estéril desionizada.
Vórtice esta muestra durante 10 segundos. Con una pipeta estándar, sumerja hacia arriba y hacia abajo varias veces para mezclar aún más la muestra. A continuación, coloque una gota de la muestra vórtice en el hemocitociómetro y calcule las concentraciones de esporas.
Ajuste la concentración a 0,1 millones de conidia por mililitro de agua destilada estéril con un volumen final de cinco mililitros. Esto se conoce como la suspensión de esporas y sólo se hace inmediatamente antes de su uso en cualquiera de los bioensayos. Para realizar la extracción floral a base de cloroformo, limpie todos los componentes con 95% de etanol dos veces.
A continuación, limpie los componentes dos veces con cloroformo para evitar la contaminación de cada extracción. No limpie las tapas forradas de PTFE con cloroformo, ya que las dañará. Después de la limpieza, deje los componentes a un lado para que se sequen al revés.
Combine una parte de flores procesadas en nueve partes de cloroformo en un vaso de precipitados añadiendo flores y luego cloroformo. Revuelva suavemente durante 30 segundos y colar a través de una pantalla de acero inoxidable en el segundo vaso de precipitados. Vierta el extracto a base de cloroformo del segundo vaso de precipitados en el tubo de cultivo de vidrio y coloque la tapa de PTFE.
Envuelva la tapa con parafilm para evitar la evaporación. Almacene el extracto floral a base de cloroformo resultante en la oscuridad para reducir la degradación de la luz a cuatro grados centígrados hasta su uso experimental. Repita las extracciones con varias muestras para proporcionar réplicas.
Para crear un dispositivo de recolección para cada ubicación seleccionada, utilice una broca conectada a una prensa de perforación para perforar un agujero en la parte inferior de una taza de pulverización. A continuación, corte una línea recta desde la parte superior del agujero hasta la boca de la taza de pulverización. Ahora taladre cuatro agujeros equidistantes lo suficientemente grandes como para enhebrar el alambre recubierto de plástico en la boca de la taza de pulverización.
Coloque un extremo de los cables recubiertos de plástico dejando un extremo libre. Taladre un agujero lo suficientemente grande como para enhebrar el spray de pintura o el adaptador de taza en una tapa de tapa centrífuga de 50 mililitros. Selle las roscas del adaptador con parafilm para evitar fugas.
Fije esto tanto a la tapa de la centrífuga como a la parte roscada de la taza del pulverizador. A continuación, conecte el tubo de centrífuga de 50 milímetros acoplado. Cree cuatro dispositivos de recopilación por ubicación de muestreo.
Implemente dispositivos en ubicaciones seleccionadas flexionando las tazas de pulverizador para que quepan en los tallos. Oriente el lado cortado de la taza del pulverizador hacia arriba utilizando los cables recubiertos de plástico unidos a otros tallos. Esto asegura que el agua que pasa sobre las flores es capturada.
Para recoger el agua de lluvia de las flores de arándano, primero punción térmica ocho agujeros equidistantes alrededor de la boca del embudo usando una sonda de metal. Inserte lazos de giro en cuatro de los agujeros. Fije los otros extremos a la ubicación opuesta de ese agujero formando un patrón de cruce ordenado.
Envuelva el embudo con parafilm y reserve. Taladre un agujero lo suficientemente grande como para insertar el vástago de conversión hacia abajo en una tapa centrífuga de 50 mililitros con una broca de paso. Inserte el embudo preparado en la tapa de la centrífuga.
Después de la lluvia o el riego por encima, retire y reemplace la porción inferior del tubo de centrífuga. Los tubos de recolección de agua de lluvia deben cambiarse rápidamente después de los eventos de humectación, ya que son propensos a la degradación de contaminantes naturales movilizados en la escorrentía, como bacterias y otros hongos. Coloque dos capas de discos de papel dentro de platos de cultivo y remoje con dos mililitros de agua destilada estéril.
A continuación, mezcle volúmenes iguales de agua destilada estéril y extracto floral a base de agua en tubos de microcentrífuga de dos mililitros. A continuación, añada un volumen igual de la suspensión de esporas a los tubos de microcentrífuga de dos mililitros preparados. La preparación resultante se conoce como una mezcla de tratamiento acuoso.
Para el control, omita la porción de extracto floral y sustitúyalo con agua destilada estéril para mantener las concentraciones conidiales consistentes. Ahora coloque los cubreobjetos de vidrio pre-limpiados en la parte superior de las toallas de papel empapadas dentro del plato de cultivo celular. Coloque una gota de 40 microlitros de mezcla de tratamiento acuoso en el centro de un cubreobjetos.
Repita esto para los tratamientos deseados, incluido el control. A continuación, cierre el plato de cultivo celular. Una vez que todos los tratamientos y réplicas han sido dispensados, coloque todos los platos de cultivo celular replicados en un recipiente de plástico sellado e incubar a 25 grados centígrados en la oscuridad.
En puntos de tiempo predeterminados, añada 10 microlitros de un fijador a las gotas para detener el crecimiento y semi-preservar el soporte. Una vez que se ha añadido un fijador, invierta cuidadosamente los cubreobjetos colocando cada uno de ellos el lado de las gotas hacia abajo en un portaobjetos de microscopio de vidrio para facilitar el examen microscópico. Cuando todos los cubreobjetos estén en los portaobjetos del microscopio de vidrio, déjelos asentarse y secarlos parcialmente en la campana de flujo durante 20 minutos.
Cuente todas las conidiias presentes en el cubreobjetos incluyendo conidia primaria, conidia germinada y conidia secundaria recién formada, así como appressoria. Trabaje a 400 veces la ampliación o 200 veces su totalizando un área de 3.808 milímetros cuadrados. En una campana de flujo laminar, agregue dos volúmenes iguales de agua destilada estéril y un volumen de suspensión de esporas a un tubo de microcentrífuga de dos mililitros.
Deje a un lado esta mezcla de tratamiento acuoso para bioensayos de extractos florales a base de cloroformo. En una campana de humo, coloque una célula Van T en un cubreobjetos de vidrio dentro del plato de cultivo celular de plástico preparado. Dispensar 33 microlitros de extracto floral a base de cloroformo deseado en el centro de la célula y dejar secar.
No toque las paredes de la celda. Para el tratamiento de control, añadir cloroformo virgen. Una vez que el extracto floral a base de cloroformo se haya secado, dispensar 99 microlitros de la mezcla de tratamiento acuoso preparada con una pipeta estándar en el centro de la célula Van T.
A continuación, cierre todos los platos de cultivo celular e incubar. En puntos de tiempo predeterminados, agregue 15 microlitros de un fijador a la célula Van T y déjelo reposar durante al menos cinco minutos para garantizar una tinción adecuada de hongos. Después de ese tiempo, retire cuidadosamente la célula Van T.
Realice los pasos de inversión y adquisición de datos de cobertura como antes. Tras la evaluación microscópica de C.fiorniae a las 24 horas después de la inoculación, la comparación de conidia en presencia de agua destilada estéril frente a extracto floral a base de agua revela un aumento dramático en la conidiación secundaria y la formación de appressorium. Sin embargo, la conidiación secundaria no fue tan evidente al comparar el control de agua destilada estéril de bioensayo cloroformo con extractos a base de cloroformo.
Más bien, el crecimiento de C.fiorniae se desplazó hacia la formación appressorial. En este ensayo, un control de agua destilada estéril y extracciones florales a base de cloroformo de arándanos fueron inspeccionadas visualmente en cero, seis, 12 y 24 horas después de la inoculación. La formación de appressorium comenzó a las seis horas en el extracto floral a base de cloroformo y aumentó constantemente a lo largo de los puntos de tiempo posteriores.
Este resultado apoya el hallazgo de que las flores reducen el tiempo necesario para formar estructuras de infección. El manejo de enfermedades para los hongos que se pudren en la fruta a menudo implica aplicaciones de fungicidas en tiempo de floración. Aquí, extractos a base de cloroformo de arándanos de múltiples etapas de crecimiento de arándano fueron evaluados visualmente para las ceras de superficie efectivas en C.fiorniae en 24 horas después de la inoculación.
Los ovarios recogidos en junio, los frutos inmaduros recogidos en julio, y en agosto, la fruta cosechada recolectada en octubre, y un control de agua destilada estéril fueron inspeccionados para la formación de appressorial. Los extractos a base de cloroformo ovárico tenían la mayor magnitud de formación appressorial, lo que indica la importancia de la floración en el ciclo de vida de C.fiorniae. El patógeno es el componente más importante de este protocolo.
Los hongos deben trasladarse a medios frescos de forma rutinaria para mantener la consistencia entre los ensayos. Cualquier trabajo con cloroformo debe realizarse en una campana de humo por razones de seguridad. Esto incluye la preparación de materiales y cristalería, procedimientos de extracción y conductancia del bioensayo a base de cloroformo.
Se pueden utilizar combinaciones de puntos de tiempo, patógenos, colecciones florales de agua de lluvia o extracciones de huéspedes para evaluar varias interacciones huésped-patógeno. Los dispositivos de recolección de agua de lluvia y los bioensayos asociados permitirán a otros trabajar con estimulantes anfitriones movilizados durante eventos de lluvia en numerosos sistemas de caminos.
