Los colorantes fluorescentes selectivos de membrana y pared celular son herramientas importantes para el análisis de la dinámica del organelélica y las células fúngicas vivas. Nuestros protocolos proporcionan antecedentes teóricos esenciales y pautas prácticas para la aplicación de una selección de estos tintes como manchas verdaderamente vitales. El punto clave para esto es utilizar concentraciones de tinte muy bajas que no causan artefactos celulares relacionados con la saturación o toxicidad del tinte, mientras que todavía proporciona buenas relaciones señal-ruido para imágenes de células vivas de alta calidad y a largo plazo.
Con colegas del Departamento de Medicina Nuclear de la universidad médica, recientemente utilizamos estas técnicas de tinción para desarrollar un enfoque novedoso para el diagnóstico guiado por imágenes de aapergilosis. La capacidad de monitorear las estructuras de membrana y pared celular en tiempo real fue crucial para determinar la dinámica de absorción del compuesto de fármaco experimental. Para comenzar este procedimiento, primero obtenga una precultura preparada.
Usa un bisturí esterilizador para cortar un pequeño bloque de agar que transporta micelio no esporulado desde el borde de la colonia de la precultura. Coloque el bloque de agar en el centro de una placa media fresca y sólida para inocular el cultivo experimental. Incubar el cultivo experimental de acuerdo con la etapa de desarrollo destinada a ser incubada.
La preparación de la muestra es algo delicada y la optimización de la configuración de adquisición de imágenes es bastante compleja. La demostración visual de ambos procedimientos acompañada de una explicación verbal facilita enormemente la replicabilidad. Para montar las muestras, mantenga listo un resbalón de cubierta de vidrio limpio de 24 por 60 milímetros y agregue 18 microlitros de solución de sal fisiológica o media mínima líquida en el centro.
Añadir dos microlitros de la solución de trabajo de 20 micromolares preparados al líquido en el centro del resbalón de la cubierta y mezclar bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces evitando la producción de burbujas de aire. Usando un bisturí limpio, corte una muestra de 15 por 15 milímetros de la periferia de la colonia y colóquelo verticalmente junto a la caída media en el resbalón de la cubierta. Utilice el bisturí para apoyar el borde superior del bloque y un dedo para mantener el lado posterior del bloque en su lugar.
Luego, baje lentamente el lado que lleva el micelio sobre el líquido. Monte la muestra preparada en la etapa del microscopio. En primer lugar, ajuste la configuración básica de adquisición de imágenes para capturar la dinámica de pie en las hifas individuales como se describe en el protocolo de texto.
Para los ensayos de absorción de endocitosis, consulte la figura uno y la tabla uno del protocolo de texto para identificar los mejores ajustes de excitación y emisión para FM 143 o FM 464 que están disponibles en el sistema de microscopía y ajuste estos ajustes en el sistema en consecuencia. Inicie la grabación de imágenes con los ajustes ajustados anteriormente y evalúe los resultados. A continuación, optimice la configuración de adquisición de imágenes a la resolución espacial y temporal necesaria para capturar el aspecto de la membrana plasmática o la dinámica de endocitosis en la que se centra el experimento.
Para la dinámica de la pared celular, consulte la figura cuatro y la tabla uno del protocolo de texto para identificar los mejores ajustes de excitación y emisión para el tinte de pared celular aplicado y ajustar los ajustes en el sistema de microscopía en consecuencia. Inicie la grabación de imágenes con los ajustes ajustados anteriormente y evalúe los resultados. A continuación, optimice la configuración de adquisición de imágenes a la resolución espacial y temporal necesaria para capturar el aspecto de la morfogénesis de la pared celular en la que se centra el experimento.
Además de visualizar simplemente los procesos celulares, las imágenes de células vivas permiten la extracción de información cuantitativa de los datos registrados. En un ejemplo de los ensayos de absorción FM 464, las muestras de hongos se cultivan como colonias y se montan mediante el método de bloque de agar invertido. Los ensayos identificaron defectos en la organización espacio-temporal de la endocitosis en la deleción de genes y mutantes sobre-expresión de genes de la proteína específica fúngica SFP 2 del atroviruro de trichoderma.
Aquí se muestran ejemplos de co-tinción FM 464 de proteínas de fusión fluorescentes dirigidas a compartimentos endocíticos. Esta co-tinción se emplea para relacionar la distribución subcelular de las dos proteínas fluorescentes verdes mejoradas etiquetadas con proteínas transmembranas, SFP 2 y GPR 1, con la vía endocítica en tridermacho atroviride. Un ejemplo de co-tinción FM 464 para la identificación de diferencias morfogenéticas muestra que esta co-tinción permite una mayor relación de la dinámica de localización subcelular de la proteína compleja polarism BUD-6 etiquetada con harina hasta el final de algunos procesos dependientes del tráfico, como la formación de septa y el crecimiento de la punta hipófal polarizada.
También caracteriza las diferencias en la organización subcelular y la arquitectura hipórica entre el tipo salvaje y las cepas mutantes de neurospora crassa. La tinción representativa de la pared celular muestra que las diferentes propiedades de interacción del calcofluor blanco, la flavina de solofenilo y el rojo congo con polímeros de pared celular resaltan las diferencias morfogenéticas entre el mutante delta SFP 2 y la cepa de tipo salvaje del atroviruro de trichoderma. El aumento del estrés de la pared celular infligido por concentraciones elevadas de tinte se produce más rápidamente y es más pronunciado en el mutante en comparación con el tipo salvaje.
Además, las mismas imágenes permiten la cuantificación de las diferencias morfogenéticas con respecto al diámetro hipófalo y la distancia septal entre ambas cepas. El monitoreo representativo en tiempo real de la biosíntesis de la pared celular indica que la muy baja concentración de blanco calcofluorante evita la saturación de la pared celular con moléculas de tinte y permite el monitoreo cuantitativo en tiempo real de la biosíntesis de la pared celular. Esto revela que la deposición de nuevo material de pared celular no es uniforme, pero responde muy rápidamente a las tensiones físicas localizadas resultantes del desplazamiento relativo de una célula sobre la unión de célula a célula antes de la dermalinfusión en neurospora crassa.
Menos es más. Utilice el menor tinte posible para evitar la interferencia del marcador fluorescente con los procesos celulares. Después de este procedimiento, se podría realizar la recuperación de la harina después de experimentos de foto-blanqueo para cuantificar la cinética de transporte y biogénesis.
La introducción pionera de la tinción de membranas y paredes celulares en hongos filamentosos a principios del milenio revolucionó literalmente la forma en que miramos los hongos. El calcofluor blanco puede causar irritaciones oculares y es un cancerigen clasificado. El rojo del Congo es cancerígeno y teratogénico, así que por favor use protección para los ojos y la piel al manipular estos tintes.
