El autor agradece a Robert Holdcraft de asistencia técnica. Este estudio fue financiado en parte por el USDA CSREES especiales Grant (2009-34155-19957) y los fondos de escotilla (NJ08192).

1. Inducción local de volátiles: el daño de herbívoros <ol><li> Dos ramas de las plantas de arándanos se embolsan con una manga de poliéster hilado. </li><li> Seis orugas de la polilla gitana (2 ª -3 ª estadios) se colocan dentro de las bolsas y se les permite alimentarse de las plantas durante 2 días antes de la recolección volátil. Las plantas de control no reciben ningún tipo de orugas. </li><li> Las emisiones de volátiles se recogen como se describe a continuación (protocolo n º 7) el día 3 (Figura 1). Fundas de poliéster permanecen en las plantas para evitar que los insectos escapen. </li></ol> 2. Inducción local de volátiles: el daño mecánico <ol><li> El daño mecánico a las plantas sean infligidos por los agujeros de perforación para imitar la cantidad de área foliar removido por la polilla gitana. </li><li> Cinco hojas por planta se lesiona con dos orificios de 7 mm situado en la base y la parte superior de las hojas al final de los días 1 y 2. El tratamiento de control no recibe daño mecánico. </li><liLas emisiones&gt; volátiles se recogen como se describe más adelante en el día 3. </li></ol> 3. Inducción local de volátiles: MeJA <ol><li> Los arándanos son tratados con 10 mL de una solución 1 mM o 1.5 de MeJA en un 0,1% de Tween-20 solución. </li><li> MeJA se aplica con una botella de 2 oz spray. Las plantas de control se rocían con 10 ml de un 0,1% de Tween-20 solución. </li><li> Las plantas son tratadas a las 16:00 horas, y se mantuvo en el invernadero durante 15 horas dentro de un diámetro de 17 cm y 35 cm de la cámara de Plexiglas de alta antes de las colecciones de volátiles. </li><li> Las emisiones de volátiles se recogen como se describe a continuación. </li></ol> 4. Inducción sistémica de volátiles: la señalización interna <ol><li> Una rama inferior de una planta de arándano se empaqueta con una funda de poliéster hilado y dañado por la colocación de seis (2 ª -3 ª estadios) las orugas de la polilla gitana dentro de la bolsa. </li><li> La rama dañada queda fuera de la cámara de recogida de volátiles, mientras que el indices arriba de la rama dañada se colocan dentro de la cámara (Figura 2). </li><li> Las orugas se les permite alimentarse de la rama más baja durante 2 días. </li><li> A partir del día 3, los compuestos volátiles se obtienen de la parte no dañada de las plantas dañadas. </li><li> Los volátiles se recogen durante 7 días consecutivos. Las plantas de control se tratan de una manera similar, pero no recibió daño de herbívoros. </li></ol> 5. Vascular conectividad <ol><li> Este estudio determinó el grado de conectividad entre las diferentes ramas vasculares dentro de una planta de arándano. </li><li> La parte final de una rama menor de una planta es cortada para apoyar una selección del agua floral con 6 ml de solución de rodamina B (Sigma-Aldrich) colorante (0,25% w / v), tal como se describe en Orians et al 11. </li><li> Movimiento del tinte a través de la planta es revisado diariamente por 7 días. </li><li> Después de 7 días, la cantidad de manchas de color rojo es evaluado visualmente desde diferentes posiciones de la planta. </li></ol> 6. La exposición a HIPVs: señalización externa <ol><li> Ramas dentro de la planta están expuestos a HIPVs de una rama de al lado o no recibió la exposición a HIPVs. </li><li> Para exponer las ramas a HIPVs, una de las ramas inferiores se empaqueta con una manga de poliéster y seis (2 ª -3 ª estadios) las orugas de la polilla gitana se colocan dentro de bolsas (Figura 3). </li><li> La planta está enjaulada dentro de una cámara de plexiglás similares a las descritas anteriormente. Los insectos pueden alimentarse de las plantas durante 2 días, de tal manera que las ramas adyacentes están expuestos a sustancias volátiles emitidas por la rama inducido. </li><li> Después de la exposición (día 3), las ramas expuestas se colocan dentro de la cámara de recolección volátil, dejando fuera de la rama de insectos heridos (como se ve en la Figura 2). </li><li> Volátiles de HIPV expuestos ramas se recogen como se describe a continuación, y la cantidad de área foliar consumida de la rama inferior se miden utilizando Scion Image Software. </li></ol> 7. La exposición a HIPVs: imprimación <ol><li> Para determinar si las plantas están &quot;preparados&quot; después de la exposición HIPV, las plantas son tratadas como en el protocolo n º 5. </li><li> La mitad de las plantas están expuestas a HIPVs de una rama de al lado inducida, mientras que la otra mitad está expuesta a las sucursales en buen estado. </li><li> El día 3, cuatro principios de 2 º estadio de orugas de la polilla gitana se colocan en cada planta y los volátiles se recogen como se describe a continuación (Figura 4). </li><li> Después de las colecciones de volátiles, deja inicialmente dañados por orugas de la polilla gitana, así como los que estén dañados en el día 3, se extirpa y las cantidades de consumo de área foliar se midió. </li></ol> 8. Colección de volátiles <ol><li> Las emisiones de HIPV se muestra en el invernadero con un sistema push-pull. La porción de tierra por encima de las plantas en maceta (tallo, ramas y hojas), incluyendo las orugas en el tratamiento de daños herbívoro, se colocan dentro de una vola 4 Lcámara de mosaico colección. Una guillotina de 2 piezas apoya la base de las plantas. Purificado el aire entra en la parte superior de cada cámara a una velocidad de 2 L / min. </li><li> Los volátiles se recogen en las trampas llenas con 30 mg de Alltech Super-Q adsorbente tirando de aire de las cámaras a una velocidad de 1 l / min. </li><li> El aparato de colección volátil consta de cuatro cámaras, teniendo en cuenta las colecciones simultánea de los volátiles de cuatro plantas diferentes (Figura 1). </li><li> Las colecciones se llevó a cabo durante el día 09:00-17:00 h. </li><li> Después de la recolección, todas las hojas de las plantas se cosechan, se seca en estufa a 60 ° C, y se pesa, y las cámaras se enjuagan con agua del grifo y el 70% de etanol. </li></ol> 9. Análisis de compuestos volátiles <ol><li> Los volátiles recogidos de Super-Q trampas se eluyen con diclorometano (150 l) y 400 ng de n-octano, se añade como estándar interno. </li><li> Separación y cuantificación de los compuestos se lleva a cabo en un Hewlett Packard 6890 SeriesCromatógrafo de Gases (GC) (Figura 5), ​​equipado con un detector de ionización de llama (FID) y un Agilent HP-1 columna (10 mx 0,53 mm x 2,65 m), y con él como gas portador (flujo constante = 5 ml / min , velocidad = 39 cm / seg). El programa de temperatura se inició a 40 ° C mantiene durante 1 min, aumentó a 14 ° C / min hasta 180 ° C (2 min), luego a 40 ° C / min hasta 200 ° C, y se mantiene a 200 ° C durante 2 minutos . </li><li> Identificación provisional de los compuestos se lleva a cabo en un Varian 3400 GC acoplado a un espectrómetro de masas Finnigan MAT 8230 (MS), equipado con un Supelco MDN-5S columna (30 mx 0,32 mm x 0,25 m), y con Él, como el gas portador. La MS se utiliza en ionización electrónica (EI) y el modo de cromatograma de iones totales (TIC) a 250 ° C (temperatura de la fuente). El programa se inició a 35 ° C (1 min), el aumento a 4 ° C / min a 170 º C, y luego a 15 ° C / min a 280 º C. </li><li> Los compuestos son tentativamente identificados por comparación de los datos espectrales con los de NIST biblioteca y bíndice de retención y GC, y mediante la comparación de sus tiempos de retención con los de los compuestos disponibles en el mercado. </li></ol> 10. Los resultados representativos: Veintidós volátiles fueron identificados a partir de hojas de arándano (Figura 6). La figura 7 muestra un cromatógrafo de representante de hojas de arándano en buen estado y las hojas dañadas por la alimentación de la polilla gitana. Daños mecánicos y la alimentación por orugas de la polilla gitana aumento de las emisiones volátiles a nivel local a partir de hojas de arándano en comparación con los controles (Figura 8). En comparación con la alimentación de la oruga, el tratamiento MeJA inducida 11 de los 17 compuestos inducidos por la polilla gitana (Figura 9). Hubo, sin embargo, no hay evidencia de la inducción sistémica de compuestos volátiles de las hojas en buen estado de gitana dañado polilla plantas de siete días después de daño por la alimentación inicial (es decir, la falta de señalización interna) (Figura 10). Además, después de una semana, se mueven muy lentoción del colorante rojo se observó entre las ramas de las plantas de arándano (Figura 11). No había conexión vascular elevado entre las hojas en una sola rama. Sin embargo, no fue intermedia a baja conectividad entre las dos ramas alineados verticalmente dentro de una sesión y baja conectividad entre las dos ramas en lados opuestos de una sesión. No hubo diferencia entre las cantidades de compuestos volátiles emitidos por las ramas expuestas a HIPVs frente a los no expuestos a HIPVs (Figura 12). Sin embargo, HIPVs actúan como señales externas de la defensiva en los arándanos. Orugas de la polilla gitana se alimentaban de hojas previamente expuestos a HIPVs consume 71% menos de material de hoja que aquellos alimentados con hojas de control no expuestos (Figura 13). Además, las cantidades de sustancias volátiles emitidas por la cantidad de área foliar que se consume en HIPV expuestos ramas fueron 4 veces mayor en comparación con las ramas no expuestos (Figura 14), lo que indica que parte de HIPV ex-<html> ramas plantean son más sensibles a los herbívoros (es decir, que fueron preparados). <img src="/files/ftp_upload/3440/3440fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Un sistema push-pull se utiliza para recoger los volátiles de plantas de arándanos. Las plantas se colocan dentro de las cámaras de vidrio y el aire limpio se pasa por encima de ellos. Un filtro que contiene un material adsorbente fue colocada en el lateral de cada cámara para atrapar los volátiles emitidos por la planta. Un vacío se utiliza para extraer el aire del interior de la cámara a través del filtro. <img src="/files/ftp_upload/3440/3440fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Para el estudio de la respuesta sistémica volátiles de las plantas de arándanos, las ramas más bajas de arándanos fueron dañados por orugas de la polilla gitana (a la derecha de la cámara) o (ventrículo izquierdo) a la izquierda en buen estado. Después de 2 días (el día 3), en buen estado volátiles de las ramas superiores de las plantas dañadas y no dañadas se recogieron. <html> CONTENIDO &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/3440/3440fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Para probar si las hojas de las ramas en buen estado responder a HIPVs de ramas dañadas, me bolsas una de las ramas en cada una de las plantas de arándanos. Entonces coloqué las orugas de la polilla gitana dentro de las bolsas de la mitad de las plantas. Las bolsas que utilizan permiten el movimiento de los volátiles desde el interior hacia el exterior de la bolsa. Las plantas se colocan dentro de Plexiglas cámaras para exponer las ramas en buen estado a HIPVs. Los compuestos volátiles fueron recopilados a partir de ramas expuestas. <img src="/files/ftp_upload/3440/3440fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Para probar si las hojas de las ramas en buen estado son &quot;preparados&quot; después de la exposición a HIPVs, los experimentos se repitieron tal como se describe en la figura 3, pero las orugas de la polilla gitana se colocaron en HIPV expuestos y no expuestos ramas dentro de cada cámara de recogida de volátiles. g &quot;alt =&quot; Figura 5 &quot;/&gt; Figura 5. Después de las colecciones de volátiles, las muestras se inyectaron en un cromatógrafo de gases (GC) para identificar y cuantificar los compuestos volátiles emitidos por plantas de arándanos. <img src="/files/ftp_upload/3440/3440fig6.jpg" alt="Figura 6"/> Figura 6. Por lo menos 22 compuestos son emitidos a partir de hojas de arándano. <img src="/files/ftp_upload/3440/3440fig7.jpg" alt="Figura 7"/> Figura 7. Cromatógrafos típicos de arándanos en buen estado las hojas y las hojas dañadas por orugas de la polilla gitana. Los volátiles se emiten en cantidades muy bajas de daños hojas de arándano. Sin embargo, cuando las hojas están dañados por orugas de la polilla gitana, la emisión de volátiles aumentado de manera espectacular. <img src="/files/ftp_upload/3440/3440fig8.jpg" alt="Figura 8"/> Figura 8. El gráfico muestra las cantidades de cada uno de los 22 compuestos volátiles emitidos por las hojas en buen estado, mechanically dañada por las hojas y las hojas dañadas por orugas de la polilla gitana. Daño artificial para simular la cantidad de área removida por las orugas aumento de las emisiones volátiles de las hojas de arándano, pero la respuesta fue diferente de la respuesta volátiles de las hojas para la alimentación de la polilla gitana. <img src="/files/ftp_upload/3440/3440fig9.jpg" alt="Figura 9"/> Figura 9. Probaron si la vía JA regula las emisiones de volátiles en las hojas de arándano. Las plantas fueron rociadas con diferentes cantidades de Meja. Me pareció que las concentraciones crecientes de forma exógena a aplicar MeJA aumento de las emisiones de compuestos volátiles de las hojas de arándano. <img src="/files/ftp_upload/3440/3440fig10.jpg" alt="Figura 10"/> Figura 10. El gráfico muestra la cantidad total de sustancias volátiles emitidas por las ramas de arándanos y el control de las ramas en buen estado de las plantas de la polilla gitana dañado (respuesta sistémica). Los compuestos volátiles fueron recogidos por un atal de 7 días consecutivos. No encontré ninguna inducción sistémica de los volátiles hasta 7 días después del daño inicial a las ramas bajas de las plantas. <img src="/files/ftp_upload/3440/3440fig11.jpg" alt="Figura 11"/> Figura 11. Yo rodamina B (colorante rojo) para determinar el grado de conectividad entre las ramas vasculares en las plantas de arándanos. Me pareció que aprox. 80%, 20%, 5% y 0% de las hojas de las ramas que contiene el tinte, las ramas justo encima de la rama que contiene el tinte, las ramas a través de la rama que contiene colorantes, y sucursales ubicadas en una sesión diferente dentro de una planta de arándano, respectivamente, fueron totalmente teñidas con el tinte. <img src="/files/ftp_upload/3440/3440fig12.jpg" alt="Figura 12"/> Figura 12. El gráfico muestra la cantidad de compuestos volátiles emitidos por las ramas expuestas a las sucursales HIPVs y no expuestos. Me pareció que la exposición a HIPVs no afectan a las emisiones volátiles en barriosaburrido ramas en buen estado de arándanos. <img src="/files/ftp_upload/3440/3440fig13.jpg" alt="Figura 13"/> Figura 13. El gráfico muestra la cantidad de la alimentación de orugas de la polilla gitana en las ramas de arándanos expuestos a las sucursales HIPVs y no expuestos. Orugas HIPV expuestos ramas consumían menos cantidad de hojas en comparación con los no expuestos en las ramas. <img src="/files/ftp_upload/3440/3440fig14.jpg" alt="Figura 14"/> Figura 14. Cuando calcula la tasa de emisión por área de consumo, me encontré con que HIPV expuestos ramas han aumentado las tasas de emisión de compuestos volátiles en comparación con las ramas expuestas, lo que indica que la exposición a HIPVs preparado las hojas en las ramas de arándanos para una respuesta mayor volatilidad.

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	<li>Dicke, M., Van Loon, J. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multitrophic+effects+of+herbivore-induced+plant+volatiles+in+an+evolutionary+context.">Multitrophic effects of herbivore-induced plant volatiles in an evolutionary context.</a> Entomol. Exp. Appl. 97, 237-237 (2000).</li><li>Mumm, R., Dicke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+natural+plant+products+and+the+attraction+of+bodyguards+involved+in+indirect+plant+defense.">Variation in natural plant products and the attraction of bodyguards involved in indirect plant defense.</a> Can. J. Zool. 88, 628-628 (2010).</li><li>Hopke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herbivore-induced+volatiles:+the+emission+of+acyclic+homoterpenes+from+leaves+of+Phaseolus+lunatus+and+Zea+mays+can+be+triggered+by+a+&#946;-glucosidase+and+jasmonic+acid.">Herbivore-induced volatiles: the emission of acyclic homoterpenes from leaves of Phaseolus lunatus and Zea mays can be triggered by a &#946;-glucosidase and jasmonic acid.</a> FEBS Lett. 352, 146-146 (1994).</li><li>Rodriguez-Saona, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+and+electrophysiological+responses+of+the+emerald+ash+borer,+Agrilus+planipennis,+to+induced+volatiles+of+Manchurian+ash,+Fraxinus+mandshurica.">Behavioral and electrophysiological responses of the emerald ash borer, Agrilus planipennis, to induced volatiles of Manchurian ash, Fraxinus mandshurica.</a> Chemoecology. 16, 75-75 (2006).</li><li>Rodriguez-Saona, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herbivore+induced+volatiles+in+the+perennial+shrub,+Vaccinium+corymbosum,+and+their+role+in+inter-branch+signaling.">Herbivore induced volatiles in the perennial shrub, Vaccinium corymbosum, and their role in inter-branch signaling.</a> J. Chem. Ecol. 35, 163-163 (2009).</li><li>Karban, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Damage-induced+resistance+in+sagebrush:+volatiles+are+key+to+intra-+and+interplant+communication.">Damage-induced resistance in sagebrush: volatiles are key to intra- and interplant communication.</a> Ecology. 87, 922-922 (2006).</li><li>Frost, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Within-plant+signalling+by+volatiles+overcomes+vascular+constraints+on+systemic+signalling+and+primes+responses+against+herbivores.">Within-plant signalling by volatiles overcomes vascular constraints on systemic signalling and primes responses against herbivores.</a> Ecol. Lett. 10, 490-490 (2007).</li><li>Heil, M., Bueno Silva, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Within-plant+signaling+by+volatiles+leads+to+induction+and+priming+of+an+indirect+plant+defense+in+nature.">Within-plant signaling by volatiles leads to induction and priming of an indirect plant defense in nature.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 5467-5467 (2007).</li><li>Turlings, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploitation+of+herbivore-induced+plant+odors+by+host-seeking+parasitic+wasps.">Exploitation of herbivore-induced plant odors by host-seeking parasitic wasps.</a> Science. 250, 1251-1251 (1990).</li><li>Makovic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volatiles+involved+in+the+nonhost+rejection+of+Fraxinus+pennsylvanica+by+Lymantria+dispar+larvae.">Volatiles involved in the nonhost rejection of Fraxinus pennsylvanica by Lymantria dispar larvae.</a> J. Agric. Food Chem. 44, 929-929 (1996).</li></ol>

No tengo nada que revelar

El push-pull aparato colección volátiles descrito aquí representa un método estándar para las colecciones del espacio de cabeza de los volátiles de las plantas. Este aparato fue utilizado para determinar la respuesta volátiles de las hojas del arándano a la herbivoría por orugas de la polilla gitana y también me permitió ofrecer nuevas pruebas para el papel de HIPVs en la señalización dentro de la planta. Los resultados presentados aquí indican que la alimentación de oruga, ex...

<table border="1"><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Cámaras volátiles colección </td><td> Analítica Research Systems, Inc. </td><td> VCC-G6X12DT-1P </td><td> Gainesville, FL </td></tr><tr><td> Compresor de aire de 20 gal, sin aceite, 2 hp </td><td> Hacia el oeste </td><td> 3JR71 </td><td> Vendido por Grainger, Inc. </td></tr><tr><td> De aire del sistema de entrega </td><td> Analítica Research Systems, Inc. </td><td> VCS-ADS-4AFM4C </td><td> Gainesville, FL </td></tr><tr><td> De aire del sistema de recogida </td><td> Analítica Research Systems, Inc. </td><td> VCS-MVCS-4CX1P </td><td> Gainesville, FL </td></tr><tr><td> Bomba de vacío 100-150V, ¼ hp </td><td> Gast Manufacturing, Inc. </td><td> <a href="http://www.grainger.com/Grainger/GAST-Vacuum-Pump-4F740">4F740</a> </td><td> Vendido por Grainger, Inc. </td></tr><tr><td> Metil jasmonato </td><td> Sigma-Aldrich &lt;/ Td&gt; <td> J2500 </td><td> St. Louis, MO </td></tr><tr><td> Tween-20 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 93773 </td><td> St. Louis, MO </td></tr><tr><td> Rodamina B </td><td> Sigma-Aldrich </td><td></td><td> St. Louis, MO </td></tr><tr><td> Botellas de plástico spray, 2 oz </td><td> Setco Inc. </td><td></td><td> Cranbury, NJ </td></tr><tr><td> Mangas de poliéster hilada </td><td> Rockingham Oportunidades Corp. </td><td></td><td> Reidsville, Carolina del Norte </td></tr><tr><td> Super-Q trampas de recolección de volátiles </td><td> Analítica Research Systems, Inc. </td><td> VCT-1/4X3-SPQ </td><td> Gainesville, FL </td></tr><tr><td> Scion imagen de software </td><td> Scion Corporation </td><td></td><td> Frederick, MD </td></tr><tr><td> Diclorometano </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 270997 </td><td> St. Louis, MO </td></tr><tr><td> Cromatógrafo de gases HP 6890 </td><td> Hewlett Packard </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cromatógrafo de gases Varian 3400 </td><td> Varian </td><td&gt; </td><td></td></tr><tr><td> n-octano </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 296988 </td><td> St. Louis, MO </td></tr><tr><td> Espectrómetro de masas MAT 8230 </td><td> Finnigan </td><td></td><td> San Jose, CA </td></tr><tr><td> HP-1 GC columna </td><td> Agilent Technologies </td><td></td><td> Palo Alto, California </td></tr><tr><td> MDN-5S GC columna </td><td> Supelco, Inc. </td><td></td><td> Bellefonte, PA </td></tr></table>

herbivore-induced blueberry volatiles and intra-plant signaling

Inducida por herbívoros-volátiles de las plantas (HIPVs) son comúnmente emitidos por las plantas después de 1,2 herbívoro ataque. Estos HIPVs se rigen principalmente por el ácido jasmónico planta defensiva hormona (JA) y su jasmonato de metilo volátiles derivados (MeJA) 3,4,5. En los últimos tres años los investigadores han documentado que HIPVs pueden repeler o atraer a los herbívoros, atraer a los enemigos naturales de los herbívoros, y en algunos casos, pueden inducir o defensas primera planta antes del ataque de herbívoros. En un reciente artículo 6, me informaron que la alimentación de orugas de la polilla gitana, la aplicación exógena MeJA, y el daño mecánico induce la emisión de compuestos volátiles de las plantas de arándanos, aunque de manera diferente. Además, las sucursales de arándanos responder a HIPVs emitida por las ramas vecinas de la misma planta, incrementando los niveles de JA y la resistencia a los herbívoros (es decir, las defensas directas de las plantas), y por las emisiones de cebado volátiles (es decir, las defensas indirectas de las plantas). Resultados similaresIngs se ha informado recientemente de artemisa 7, 8 álamo, y habas 9 .. Aquí, se describe un método push-pull para la recolección de arándanos volátiles inducidos por herbívoros (lagarta peluda) la alimentación, la aplicación exógena MeJA, y los daños mecánicos. La unidad de recogida volátiles consiste en una cámara de recogida de 4 L volátiles, una guillotina de 2 piezas, un sistema de suministro de aire que purifica el aire de entrada, y un sistema de vacío conectado a una trampa llena de Super-Q absorbente para recoger los volátiles 5,6,10 . Volátiles recogidas en el Super-Q trampas se eluyen con diclorometano y se separan y se cuantificó mediante cromatografía de gases (GC). Este método de recogida de volátiles se utilizó n-6 mi estudio para investigar la respuesta de la volatilidad de las ramas en buen estado a la exposición a los volátiles de las ramas dañadas por herbívoros en las plantas de arándanos. Estos métodos se describen a continuación. En pocas palabras, en buen estado las ramas de arándano están expuestos a HIPVs lado a otrom vecinos ramas dentro de la misma planta. Usando las mismas técnicas descritas anteriormente, los compuestos volátiles emitidos por las ramas después de la exposición a HIPVs se recogen y analizan.

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Herbivore-induced Blueberry Volatiles and Intra-plant Signaling

Un método push-pull para la recolección de plantas volátiles se describe. El método permite la comparación de los volátiles inducidos por la alimentación de los herbívoros, metil jasmonato exógenas, y los daños mecánicos. Esta técnica también se utiliza para investigar la respuesta de la volatilidad de las ramas en buen estado a la exposición a los volátiles de las ramas dañadas por herbívoros en las plantas de arándanos.

Inducida por herbívoros-Volátiles Blueberry y señalización dentro de la planta

Herbivore-induced plant volatiles (HIPVs) are commonly emitted from plants after herbivore attack1,2.  These HIPVs are mainly regulated by the defensive ...

herbivore-induced-blueberry-volatiles-and-intra-plant-signaling

Research

JoVE Journal

Biology

16.3K vistas.  Rutgers University. Un método push-pull para la recolección de plantas volátiles se describe. El método permite la comparación de los volátiles inducidos por la alimentación de los herbívoros, metil jasmonato exógenas, y los daños mecánicos. Esta técnica también se utiliza para investigar la respuesta de la volatilidad de las ramas en buen estado a la exposición a los volátiles de las ramas dañadas por herbívoros en las plantas de arándanos.

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Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Las secciones incluidas en parafina y congeladas de Drosophila Los músculos de Adultos

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Investigación

Biología

Assessing Signaling Properties of Ectodermal Epithelia During Craniofacial Development

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue interactions that regulate patterning and morphogenesis of vertebrates (e.g., 1, 2, 3, 4). Here, we illustrate a method that exploits this accessibility to test the signaling and patterning properties of ectodermal tissues during facial development. In these experiments, we create quail-chick 5 or mouse-chick 6 chimeras by transplanting the surface cephalic ectoderm that covers the upper jaw from quail or mouse onto either the same region or an ectopic region of chick embryos. The use of quail as donor tissue for transplantation into chicks was developed to take advantage of a nucleolar marker present in quail but not chick cells, thus allowing investigators to distinguish host and donor tissues 7. Similarly, a repetitive element is present in the mouse genome and is expressed ubiquitously, which allows us to distinguish host and donor tissues in mouse-chick chimeras 8. The use of mouse ectoderm as donor tissue will greatly extend our understanding of these tissue interactions, because this will allow us to test the signaling properties of ectoderm derived from various mutant embryos.

This article describes a tissue transplantation technique that was designed to test the signaling and patterning properties of surface cephalic ectoderm during craniofacial development.

La evaluación de las propiedades de señalización de ectodérmica epitelio durante el desarrollo craneofacial

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue ...

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Cell polarity is a fundamental property of eukaryotic cells that is dynamically regulated by both intrinsic and extrinsic factors during embryonic development 1, 2. One of the signaling pathways involved in this regulation is the Wnt pathway, which is used many times during embryogenesis and critical for human disease3, 4, 5. Multiple molecular components of this pathway coordinately regulate signaling in a spatially-restricted manner, but the underlying mechanisms are not fully understood. Xenopus embryonic epithelial cells is an excellent system to study subcellular localization of various signaling proteins. Fluorescent fusion proteins are expressed in Xenopus embryos by RNA microinjection, ectodermal explants are prepared and protein localization is evaluated by epifluorescence. In this experimental protocol we describe how subcellular localization of Diversin, a cytoplasmic protein that has been implicated in signaling and cell polarity determination6, 7 is visualized in Xenopus ectodermal cells to study Wnt signal transduction8. Coexpression of a Wnt ligand or a Frizzled receptor alters the distribution of Diversin fused with red fluorescent protein, RFP, and recruits it to the cell membrane in a polarized fashion 8, 9. This ex vivo protocol should be a useful addition to in vitro studies of cultured mammalian cells, in which spatial control of signaling differs from that of the intact tissue and is much more difficult to analyze.

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Xenopus embryonic ectoderm has become an attractive model for studies of cell polarity. An assay is described, in which subcellular distribution of fluorescent proteins is assessed in ectoderm cells. This protocol will help address questions related to spatial control of signaling.

Translocación polarizado de proteínas fluorescentes en Xenopus Ectodermo en respuesta a la señalización de Wnt

Cell polarity is a fundamental property of eukaryotic cells that is dynamically regulated by both intrinsic and extrinsic factors during embryonic ...

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative stress refers to the aberrant formation of ROS (reactive oxygen species), which include O2&bull;-, H2O2, and hydroxyl radicals. Reactive oxygen species influences a multitude of cellular processes including signal transduction, cell proliferation and cell death1-6. ROS have the potential to damage vascular and organ cells directly, and can initiate secondary chemical reactions and genetic alterations that ultimately result in an amplification of the initial ROS-mediated tissue damage. A key component of the amplification cascade that exacerbates irreversible tissue damage is the recruitment and activation of circulating inflammatory cells. During inflammation, inflammatory cells produce cytokines such as tumor necrosis factor-&alpha; (TNF&alpha;) and IL-1 that activate endothelial cells (EC) and epithelial cells and further augment the inflammatory response7. Vascular endothelial dysfunction is an established feature of acute inflammation. Macrophages contribute to endothelial dysfunction during inflammation by mechanisms that remain unclear. Activation of macrophages results in the extracellular release of O2&bull;- and various pro-inflammatory cytokines, which triggers pathologic signaling in adjacent cells8. NADPH oxidases are the major and primary source of ROS in most of the cell types. Recently, it is shown by us and others9,10 that ROS produced by NADPH oxidases induce the mitochondrial ROS production during many pathophysiological conditions. Hence measuring the mitochondrial ROS production is equally important in addition to measuring cytosolic ROS. Macrophages produce ROS by the flavoprotein enzyme NADPH oxidase which plays a primary role in inflammation. Once activated, phagocytic NADPH oxidase produces copious amounts of O2&bull;- that are important in the host defense mechanism11,12. Although paracrine-derived O2&bull;- plays an important role in the pathogenesis of vascular diseases, visualization of paracrine ROS-induced intracellular signaling including Ca2+ mobilization is still hypothesis. We have developed a model in which activated macrophages are used as a source of O2&bull;- to transduce a signal to adjacent endothelial cells. Using this model we demonstrate that macrophage-derived O2&bull;- lead to calcium signaling in adjacent endothelial cells.

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

An efficient method to gain insights into visualizing the paracrine-derived ROS induction of endothelial Ca2+ signaling is described. This method takes advantage of measuring paracrine derived ROS triggered Ca2+ mobilization in vascular endothelial cells in a co-culture model.

Visualización de Ca Vascular 2 + Señalización desencadenada por paracrina derivados ROS

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative ...

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host plant.1,2 When a host plant is an important agronomic commodity feeding damage by insect pests can inflict serious economic losses to growers. Accordingly, kairomones can be used as attractants to lure or confuse these insects and, thus, offer an environmentally friendly alternative to pesticides for insect control.3 Unfortunately, plants can emit a vast number volatiles with varying compositions and ratios of emissions dependent upon the phenology of the commodity or the time of day. This makes identification of biologically active components or blends of volatile components an arduous process. To help identify the bioactive components of host plant volatile emissions we employ the laboratory-based screening bioassay electroantennography (EAG). EAG is an effective tool to evaluate and record electrophysiologically the olfactory responses of an insect via their antennal receptors. The EAG screening process can help reduce the number of volatiles tested to identify promising bioactive components. However, EAG bioassays only provide information about activation of receptors. It does not provide information about the type of insect behavior the compound elicits; which could be as an attractant, repellent or other type of behavioral response. Volatiles eliciting a significant response by EAG, relative to an appropriate positive control, are typically taken on to further testing of behavioral responses of the insect pest. The experimental design presented will detail the methodology employed to screen almond-based host plant volatiles4,5 by measurement of the electrophysiological antennal responses of an adult insect pest navel orangeworm (Amyelois transitella) to single components and simple blends of components via EAG bioassay. The method utilizes two excised antennae placed across a "fork" electrode holder. The protocol demonstrated here presents a rapid, high-throughput standardized method for screening volatiles. Each volatile is at a set, constant amount as to standardize the stimulus level and thus allow antennal responses to be indicative of the relative chemoreceptivity. The negative control helps eliminate the electrophysiological response to both residual solvent and mechanical force of the puff. The positive control (in this instance acetophenone) is a single compound that has elicited a consistent response from male and female navel orangeworm (NOW) moth. An additional semiochemical standard that provides consistent response and is used for bioassay studies with the male NOW moth is (Z,Z)-11,13-hexdecadienal, an aldehyde component from the female-produced sex pheromone.6-8

A method to rapidly screen host plant volatiles by measurement of the electrophysiological response of adult navel orangeworm (Amyelois transitella) antennae to single components and blends via electroantennographic analysis is demonstrated.

Bioensayo electroantenográfico como herramienta de detección de compuestos volátiles de las plantas hospederas

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the brain, liver, retina, cochlea and vasculature. In experimental settings, intercellular Ca2+-waves can be elicited by applying a mechanical stimulus to a single cell. This leads to the release of the intracellular signaling molecules IP3 and Ca2+ that initiate the propagation of the Ca2+-wave concentrically from the mechanically stimulated cell to the neighboring cells. The main molecular pathways that control intercellular Ca2+-wave propagation are provided by gap junction channels through the direct transfer of IP3 and by hemichannels through the release of ATP. Identification and characterization of the properties and regulation of different connexin and pannexin isoforms as gap junction channels and hemichannels are allowed by the quantification of the spread of the intercellular Ca2+-wave, siRNA, and the use of inhibitors of gap junction channels and hemichannels. Here, we describe a method to measure intercellular Ca2+-wave in monolayers of primary corneal endothelial cells loaded with Fluo4-AM in response to a controlled and localized mechanical stimulus provoked by an acute, short-lasting deformation of the cell as a result of touching the cell membrane with a micromanipulator-controlled glass micropipette with a tip diameter of less than 1 &mu;m. We also describe the isolation of primary bovine corneal endothelial cells and its use as model system to assess Cx43-hemichannel activity as the driven force for intercellular Ca2+-waves through the release of ATP. Finally, we discuss the use, advantages, limitations and alternatives of this method in the context of gap junction channel and hemichannel research.

Intercellular Ca2+-waves are driven by gap junction channels and hemichannels. Here, we describe a method to measure intercellular Ca2+-waves in cell monolayers in response to a local single-cell mechanical stimulus and its application to investigate the properties and regulation of gap junction channels and hemichannels.

Mecánica estimulación inducida por calcio Propagación de Ondas en monocapas de células: el ejemplo de las especies bovina células endoteliales corneales

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

Metabólicas etiquetado y de membrana de fraccionamiento para Comparativo Proteómica Análisis de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Culturas suspensión celular

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult cardiomyocytes are widely accepted as a good model for cardiac cellular physiology and pathophysiology, as well as for pharmaceutical intervention. Genetically modified mice preclude the need for complicated cardiomyocyte infection processes to generate the desired genotype, which are inefficient due to cardiomyocytes&#8217; terminal differentiation. Isolation and culture of high quantity and quality functional cardiomyocytes will dramatically benefit cardiovascular research and provide an important tool for cell signaling transduction research and drug development. Here, we describe a well-established method for isolation of adult mouse cardiomyocytes that can be implemented with little training. The mouse heart is excised and cannulated to an isolated heart system, then perfused with a calcium-free and high potassium buffer followed by type II collagenase digestion in Langendorff retrograde perfusion mode. This protocol yields a consistent result for the collection of functional adult mouse cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

We describe a reliable method for isolation of adult mouse cardiomyocytes. This protocol yields a consistent result for the culture of functional adult cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

Aislamiento y cultivo de ratón adulto cardiomiocitos de Señalización Celular y<em&gt; In vitro</em&gt; Hipertrofia Cardíaca

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

La medición de la tasa metabólica en<em&gt; Drosophila</em&gt; Mediante respirometría

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

LED Thermo Flow &#8212; Combining Optogenetics with Flow Cytometry

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the controlled delivery of light to the cell sample and hence the most popular tools for optogenetic studies are microscopy-based cell analyses and in vitro experiments. The flow cytometer has major advantages over a microscope, including the ability to rapidly measure thousands of cells at single cell resolution. However, it is not yet widely used in optogenetics. Here, we present a device that combines the power of optogenetics and flow cytometry: the LED Thermo Flow. This device illuminates cells at specific wavelengths, light intensities and temperatures during flow cytometric measurements. It can be built at low cost and be used with most common flow cytometers. To demonstrate its utility, we characterized the photoswitching kinetics of Dronpa proteins in vivo and in real time. This protocol can be adapted to almost all optically controlled substances and substantially expands the set of possible experiments. More importantly, it will greatly simplify the discovery and development of new optogenetic tools.

LED Thermo Flow &amp;#8212; Combining Optogenetics with Flow Cytometry

Optically controlled substances are powerful tools to study signaling pathways. To expand the spectrum of possible experiments, we developed a device for studying optically controlled substances in real time using flow cytometry: the LED Thermo Flow.

Thermo LED Flujo - Combinando optogenética con Citometría de Flujo

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the ...