La cristalografía de rayos X es la técnica dominante para determinar la información estructural 3D a partir de proteínas. Las líneas de haz de sincrotrón son necesarias para obtener datos de los cristales pequeños y débilmente difractizantes que producen las proteínas. Massive es una línea de haz única porque automatiza completamente el proceso de recopilación de datos de macromoléculas biológicas.
Desde el montaje de muestras, la ubicación y la recopilación final de datos. La automatización completa de este tipo es muy importante, ya que permite a los investigadores pasar su tiempo en el laboratorio, en lugar de recopilar datos en la línea de haz. La línea de haz también es inteligente y, en promedio, puede recopilar mejores datos que cuando la línea de haz es operada por los seres humanos.
Para comenzar este protocolo, realice el montaje de cristal y solicite el tiempo de haz en Massive uno como se describe en el protocolo de texto. Navegue hasta el sistema de información para las líneas de haz de cristalografía de proteínas, o el sitio web de ISPyB. Elija experimentos MX, inicie sesión con el número de experimento y la contraseña.
Haga clic en el envío, agregue nuevo y proporcione la información necesaria. A continuación, haga clic en Guardar. Haga clic en Agregar parcela y rellene la información solicitada.
Haga clic en Guardar y, a continuación, haga clic en Agregar contenedor. Dar el código de barras del disco como el nombre, y elegir disco de la columna vertebral, de nuevo haga clic en guardar. Haga clic en el símbolo del contenedor y edite, y rellene la información necesaria sobre las muestras, como el nombre de la proteína, el flujo de trabajo preferido y la posición del cristal, en el disco.
Elija la proteína que ha sido aprobada por el grupo de seguridad ESRF. Escriba un nombre de muestra único para identificar cada muestra individual. Opcionalmente, escanee el código de barras del pin.
El resto de la información que se va a incluir también es opcional. Para cada muestra individual, especifique el tipo de experimento. Esto define qué flujo de trabajo automático se utilizará para procesar cada cristal.
Dado que los cristales GCSH son agujas, elija MX presione P.Next, ingrese un grupo espacial. Si está presente, esto se utilizará para los cálculos de estrategia de recopilación de datos y para las líneas de tuberías de procesamiento de datos automáticos disponibles. Introduzca la resolución deseada.
Esto define la distancia de cristal a detector desde los escaneos de malla iniciales, la caracterización y la recopilación de datos predeterminada. Ahora, establezca la resolución de umbral deseada para evitar la recopilación de conjuntos de datos completos de cristales que no difractifien a este límite. Esto puede ahorrar espacio de almacenamiento de datos y analizar el tiempo.
Establezca la integridad necesaria. A continuación, establezca la multiplicidad necesaria. Si hay más de un cristal en el soporte de la muestra, establezca el número máximo de cristales que se analizarán.
El valor predeterminado es uno o cinco para la pulsación MX P.El tamaño de viga adecuado también se puede seleccionar. Coloque el grupo de espacio, si se conoce, en la columna del grupo de espacio de fuerza. A continuación, ajuste la sensibilidad a la radiación de los cristales.
Si lo desea, establezca el ángulo de rotación total que se recopilará para la recopilación completa del conjunto de datos. Una vez que toda la información se ha introducido en el sistema, guarde los valores. Haga clic en, devuelva a los envíos y pulse Enviar envío a ESRF.
Imprima la etiqueta de envío y envíe las muestras. Los usuarios deben organizar una recogida con un mensajero utilizando los detalles de la cuenta ESRF. El día del experimento, las muestras se transfieren al enorme rocío de alta capacidad.
Los científicos de la línea de haz inician la recopilación de datos, que pueden seguir los usuarios de forma remota. Para cada tipo de ejemplo diferente, los usuarios reciben un correo electrónico informándoles de que se ha iniciado la recopilación de datos. La ejecución de todos los pasos en todos los flujos de trabajo se puede seguir en línea y en tiempo real.
Esto es accesible para el usuario iniciando sesión en ISPyB. Los resultados también se pueden ver y descargar. Para cada muestra analizada, examine los resultados del experimento automático en ISPyB.
Haga clic en la sesión experimental deseada en ID30A1. Seleccione la canalización de procesamiento automático preferida. Descargue los datos escritos en el grupo de espacio correcto con la mayor integridad y resolución más alta.
Haciendo clic en el último recoger resultados y luego descargar. El flujo de trabajo MX press P fue utilizado por la línea de haz ESRF Massive one para montar completamente automáticamente, centrarse en el haz de rayos X, caracterizar y recopilar conjuntos completos de datos de difracción de una serie de cristales de GCSH humano. Las muestras fueron montadas y el bucle analizado para un área para escanear.
Después de los análisis de difracción, se seleccionaron cuatro puntos dentro del cristal para la recopilación de datos. La determinación manual de la estructura por reemplazo molecular produjo un mapa de densidad de electrones de alta calidad después de un único ciclo de refinamiento automatizado. Para este conjunto de datos, la canalización automatizada cortó los datos en una resolución de un punto tres angstrom.
Sin embargo, los usuarios pueden decidir cortar los datos con una resolución más baja. La densidad continua de electrones es visible para toda la cadena de aminoácidos, aparte de la etiqueta de histidina eterminal. De las cuatro sustituciones que distinguen la GCSH humana y bovina, tres son fácilmente identificables en la densidad de electrones.
Esto es menos claro para el ácido aspártico a la sustitución de lisina 125. Para lo cual la densidad de electrones de la cadena lateral sólo se resuelve parcialmente debido a la flexibilidad. El modelo obtenido actualmente tiene un valor de trabajo R de 20 puntos cuatro por ciento y un valor libre de R de 23 puntos ocho por ciento y se puede optimizar aún más mediante ciclos adicionales de construcción y refinamiento de modelos automatizados y manuales.
Es importante adaptar los requisitos a su sistema. Por ejemplo, establecer la resolución ya observada en un valor conocido puede ahorrar tiempo y garantizar una mejor recopilación de datos. La recopilación de datos totalmente automática ha democratizado la cristalografía y ahora incluso los laboratorios pequeños pueden embarcarse en un proyecto famoso cuando esto era factible antes sólo con un enorme poder del hombre.
