La cristallographie aux rayons X est la technique dominante pour déterminer l’information structurale 3D à partir de protéines. Des lignes de faisceau de synchrotron sont nécessaires pour obtenir des données des petits cristaux faiblement diffracting que les protéines produisent. Massive est une ligne de faisceau unique parce qu’elle automatise entièrement le processus de collecte de données à partir de macromolécules biologiques.
À partir du montage d’échantillons, de l’emplacement et de la collecte finale de données. L’automatisation complète de ce type est très importante car elle permet aux chercheurs de passer leur temps en laboratoire, au lieu de recueillir des données sur la ligne de faisceau. La ligne de faisceau est également intelligente et, en moyenne, peut recueillir de meilleures données que lorsque la ligne de faisceau est actionnée par des humains.
Pour commencer ce protocole, effectuez le montage de cristal et demandez le temps de faisceau sur massive tel que décrit dans le protocole de texte. Accédez au système d’information pour les lignes de faisceau de cristallographie protéique, ou au site Web de l’ISPyB. Choisissez des expériences MX, connectez-vous avec le numéro d’expérience et le mot de passe.
Cliquez sur l’expédition, ajoutez de nouvelles informations et fournissez les informations nécessaires. Cliquez ensuite enregistrer. Cliquez sur ajouter le colis et remplissez les informations demandées.
Cliquez sur enregistrer, puis cliquez sur ajouter le conteneur. Donnez le code à barres de la rondelle comme nom, et choisissez la rondelle de la colonne vertébrale, cliquez à nouveau enregistrer. Cliquez sur le symbole du conteneur et modifiez, et remplissez les informations nécessaires concernant les échantillons tels que le nom de protéine, le flux de travail préféré, et la position cristalline, dans la rondelle.
Choisissez la protéine qui a été approuvée par le groupe de sécurité ESRF. Entrez un nom d’échantillon unique pour identifier chaque échantillon individuel. En option, numérisez le code à barres pin.
Le reste de l’information à inclure est également facultatif. Pour chaque échantillon individuel, entrez le type d’expérience. Cela définit quel flux de travail automatique sera utilisé pour traiter chaque cristal.
Étant donné que les cristaux GCSH sont des aiguilles, choisissez MX appuyez sur P.Next, entrez dans un groupe spatial. S’il est présent, il sera utilisé pour le calcul de la stratégie de collecte de données et par les lignes automatiques de traitement des données disponibles. Entrez la résolution désirée.
Cela définit la distance du cristal au détecteur par rapport aux balayages de maille initiaux, la caractérisation et la collecte de données par défaut. Maintenant, définissez la résolution de seuil souhaitée pour empêcher la collecte d’ensembles de données complets à partir de cristaux qui ne se diffractent pas à cette limite. Cela peut économiser de l’espace de stockage de données et analyse le temps.
Définissez l’exhaustivité requise. Réglez ensuite la multiplicité requise. Si plus d’un cristal est contenu sur le support de l’échantillon, définissez le nombre maximum de cristaux à analyser.
La valeur par défaut est d’un ou cinq pour la presse MX P.La taille appropriée du faisceau peut également être sélectionnée. Mettez dans le groupe spatial, s’il est connu, dans la colonne de groupe spatial de force. Réglez ensuite la sensibilité au rayonnement des cristaux.
Si vous le souhaitez, définissez l’angle de rotation total à collecter pour la collecte complète de l’ensemble de données. Une fois que toutes les informations ont été entrées dans le système, enregistrez les valeurs. Cliquez dessus, retournez aux envois et appuyez sur envoyer l’envoi à l’ESRF.
Imprimez l’étiquette d’expédition et envoyez les échantillons. Les utilisateurs doivent organiser un ramassage avec un courrier en utilisant les détails du compte ESRF. Le jour de l’expérience, les échantillons sont transférés à la rosée massive d’une grande capacité.
Les scientifiques de la ligne beam lancent ensuite la collecte de données, qui peut être suivie par les utilisateurs à distance. Pour chaque type d’échantillon différent, les utilisateurs reçoivent un e-mail les informant que la collecte de données a commencé. L’exécution de toutes les étapes de tous les flux de travail peut être suivie en ligne et en temps réel.
Ceci est accessible à l’utilisateur en se connectant à ISPyB. Les résultats peuvent également être consultés et téléchargés. Pour chaque échantillon analysé, examinez les résultats de l’expérience automatique sur ISPyB.
Cliquez sur la session expérimentale souhaitée à ID30A1. Sélectionnez le pipeline de traitement automatique préféré. Téléchargez les données écrites dans le groupe spatial correct avec la plus grande compléttivité et la résolution la plus élevée.
En cliquant sur les derniers résultats de collecte, puis télécharger. Le flux de travail MX press P a été utilisé par la ligne de faisceau ESRF Massive pour monter entièrement automatiquement, centrer dans le faisceau de rayons X, caractériser et collecter des ensembles de données de diffraction complète à partir d’une série de cristaux de GCSH humain. Les échantillons ont été montés et la boucle analysée pour une zone à numériser.
Après les analyses de diffraction, quatre points ont été sélectionnés dans le cristal pour la collecte de données. La détermination manuelle de la structure par remplacement moléculaire a donné une carte de densité électronique de haute qualité après un seul cycle automatisé de raffinement. Pour cet ensemble de données, le pipeline automatisé a coupé les données à un point trois deux résolution angstrom.
Toutefois, les utilisateurs peuvent décider de couper les données à une résolution inférieure. La densité continue d’électrons est visible pour toute la chaîne d’acides aminés en dehors de l’étiquette d’histidine éterminale. Sur les quatre substitutions qui distinguent le GCSH humain et bovin, trois sont facilement identifiables dans la densité des électrons.
C’est moins clair pour l’acide aspartique de lysine 125 substitution. Pour lequel la densité électronique de la chaîne latérale n’est que partiellement résolue en raison de la flexibilité. Le modèle actuellement obtenu a une valeur de travail R de 20 points quatre pour cent et une valeur R libre de 23 points huit pour cent et peut être encore optimisé par des cycles supplémentaires de construction et de raffinement de modèles automatisés et manuels.
Il est important d’adapter les exigences à votre système. Par exemple, le réglage de la résolution déjà observée à une valeur connue peut gagner du temps et assurer une meilleure collecte de données. La collecte de données entièrement automatique a démocratisé la cristallographie et maintenant même les petits laboratoires peuvent se lancer dans un projet célèbre alors que cela n’était possible auparavant qu’avec une énorme puissance de l’homme.
