La detección de compuestos orgánicos más pequeños llamados fragmentos mediante cristalografía de rayos X es un método eficiente para identificar moléculas que son puntos de partida para el descubrimiento de fármacos o el desarrollo de compuestos de herramientas bioquímicas. La investigación cristalográfica del fragmento reveló no sólo la identidad, pero también donde y cómo los fragmentos atan en la superficie de la proteína bajo estudio. Esta técnica se puede utilizar en cada diana de proteínas bioquímica o médicamente relevante para la que se puedan cultivar cristales de proteínas adecuados.
La calidad de los resultados está íntimamente relacionada con la calidad del manejo de la muestra. Creemos que la siguiente demostración visual ayudará a los investigadores a llevar a cabo experimentos de alta calidad. Demostrando el procedimiento estará Tatjana Barthel, investigadora doctoral y estudiante de doctorado en mi laboratorio.
Para comenzar, abra la bolsa de la placa de cribado precalentada a temperatura ambiente, luego retire la tapa y la lámina de la placa de cribado. Decantar la solución de remojo de cinco mililitros en el depósito de reactivos. A continuación, llene cada uno de los 96 depósitos de la placa con 40 microlitros de solución de remojo utilizando una pipeta de 12 canales.
Coloque el marco de fácil acceso en la parte superior de la placa de cribado y apriételo con las abrazaderas incluidas deslizándolas sobre el lado izquierdo y derecho del dispositivo. Coloque la placa de cribado y el marco de fácil acceso bajo el microscopio y deslice el primer pozo moviendo la baldosa de vidrio acrílico respectiva del marco. Añadir 0,4 microlitros de solución de remojo del depósito al fragmento que contiene bien utilizando una punta de pipeta fresca.
Asegúrese de que la gota cubra el fragmento seco. Coloque la placa de cristalización que contiene los cristales más grandes bajo el segundo microscopio y abra la lámina de sellado en uno de los pozos. Usando un lazo del tamaño apropiado, transfiera un cristal al pozo de la placa de cribado bajo el primer microscopio.
Lave el lazo en la placa de vidrio preparada, luego séquelo tocándolo suavemente en el tejido. Haga esto después de cada transferencia para evitar la contaminación cruzada. Utilice el microscopio para asegurarse de que el cristal se ha colocado correctamente.
Repita el procedimiento para el segundo cristal. Pase al siguiente pozo y repita el procedimiento para todos los pozos restantes. Después de que los cristales se hayan transferido a los 96 pozos de la placa de cribado, retire la placa de cribado junto con el marco de fácil acceso desde debajo del microscopio y colóquela en el banco o la mesa.
Luego retire el marco de fácil acceso de la placa de cribado, selle la placa de cribado con papel de sellado y colóquelo en la incubadora o armario de cristalización para incubar durante el tiempo de remojo previamente optimizado. Dos horas de incubación son suficientes, pero durante la noche puede ser más conveniente. Prepare la espuma Unipuck Dewar con tres tapas Unipuck y llénese la mitad con nitrógeno líquido, manteniéndolo en el suelo.
Mueva el Dewar medio lleno al banco y llénelo completamente hasta el borde. Manténgalo lleno hasta el borde superior durante todo el experimento y reemplace el nitrógeno líquido con frecuencia. Recupere la placa de cribado de la incubadora y retire su lámina.
Coloque el marco de fácil acceso en la parte superior. Deslice el primer pozo. Cosechar un cristal de la gota y flash enfriarlo en nitrógeno líquido sumergiéndose con un movimiento vertical rápido.
Inserte la muestra en la posición de disco adecuada y tome las notas pertinentes en la hoja de seguimiento de la muestra. Repita el procedimiento para el segundo cristal. Ir al siguiente pozo y repetir la colocación de otros cristales hasta que los tres discos estén llenos.
Pre-enfríe las bases de Unipuck en nitrógeno líquido, y añádalas encima de las tapas. Guarde los Unipucks en un estante de almacenamiento en un Dewar de transporte o Dewar de almacenamiento. Manténgalos en nitrógeno líquido a temperaturas criogénicas hasta su medición.
Repita el mismo procedimiento de cosecha y almacenamiento de los cristales en Unipucks para las muestras restantes en la placa de cribado. La variabilidad de las morfologías cristalinas después de realizar el remojo del fragmento y la recolección de cristales se muestra aquí. Incluso se incluyeron cristales que parecen algo deteriorados, ya que todavía resultan en datos útiles.
Los datos fueron recolectados en las líneas de haz 14.1 y 14.2 en el sincrotrón BESSY II. Se realizó la recolección de datos de difracción para cada muestra. Los datos se analizaron utilizando FragMAXapp, centrándose en la combinación de XDSAPP para el procesamiento, fspipeline para el refinamiento de la estructura y PenDA para la búsqueda de aciertos.
Esto dio lugar a 15 golpes en el complejo de la proteína de AR usando una condición de remojo libre de DMSO. En una campaña anterior de la pantalla de entrada F2X contra el mismo objetivo, incluyendo DMSO en la condición de remojo, se encontraron 20 golpes. Esto significa que el 75% de los golpes pueden ser identificados si se omite DMSO.
Para el éxito del experimento, es crucial que los cristales se manejen correctamente y con cuidado durante cada paso del procedimiento. La investigación cristalográfica del fragmento ha madurado a una técnica extensamente utilizada, que se aplica a menudo en academia y en la industria farmacéutica.
