A cristalografia de raios-X é a técnica dominante para determinar informações estruturais 3D de proteínas. Linhas de feixe síncrotron são necessárias para obter dados dos cristais pequenos e fracamente difundidores que as proteínas produzem. Massive one é uma linha de feixe única porque automatiza totalmente o processo de coleta de dados a partir de macromoléculas biológicas.
Desde a montagem da amostra, localização e coleta final de dados. A automação completa desse tipo é muito importante, pois permite que os pesquisadores passem seu tempo em laboratório, em vez de coletar dados na linha de feixe. A linha de feixe também é inteligente e, em média, pode coletar dados melhores do que quando a linha de feixe é operada por humanos.
Para iniciar este protocolo, realize a montagem de cristal e solicite tempo de feixe em Massive one, conforme descrito no protocolo de texto. Navegue até o sistema de informações para linhas de feixe de cristalografia de proteínas, ou site ispyb. Escolha experimentos MX, faça login com o número do experimento e senha.
Clique na remessa, adicione novas e forneça as informações necessárias. Em seguida, clique em salvar. Clique em adicionar parcela e preencha as informações solicitadas.
Clique em salvar e clique em adicionar contêiner. Dê o código de barras do disco como nome, e escolha o disco da coluna, clique novamente em salvar. Clique no símbolo do recipiente e edite e preencha as informações necessárias sobre as amostras, como nome da proteína, fluxo de trabalho preferido e posição de cristal, no disco.
Escolha a proteína que foi aprovada pelo grupo de segurança ESRF. Digite um nome de amostra único para identificar cada amostra individual. Opcionalmente, escaneie o código de barras do pino.
O resto das informações a serem inclusivas também é opcional. Para cada amostra individual, digite o tipo de experimento. Isso define qual fluxo de trabalho automático será usado para processar cada cristal.
Dado que os cristais GCSH são agulhas, escolha MX pressione P.Next, entre em um grupo espacial. Se presente, este será usado para cálculos de estratégia de coleta de dados e pelas linhas automáticas de tubos de processamento de dados disponíveis. Digite a resolução desejada.
Isso define a distância do cristal ao detector das varreduras iniciais de malha, caracterização e coleta de dados padrão. Agora, defina a resolução de limiar desejada para evitar a coleta de conjuntos de dados completos de cristais que não difratam a este limite. Isso pode salvar o espaço de armazenamento de dados e analisar o tempo.
Defina a completude necessária. Em seguida, defina a multiplicidade necessária. Se mais de um cristal estiver contido no suporte da amostra, defina o número máximo de cristais a serem analisados.
O valor padrão é de um ou cinco para MX press P.O tamanho do feixe apropriado também pode ser selecionado. Coloque no grupo espacial, se conhecido, na coluna do grupo espacial force. Em seguida, ajuste a sensibilidade de radiação dos cristais.
Se desejar, defina o ângulo de rotação total a ser coletado para a coleta completa do conjunto de dados. Uma vez que todas as informações foram inserindo no sistema, salve os valores. Clique, retorne aos embarques e pressione enviar envio para a ESRF.
Imprima a etiqueta de envio e envie as amostras. Os usuários devem organizar uma coleta com um mensageiro usando os detalhes da conta ESRF. No dia do experimento, as amostras são transferidas para o Massive one high capacit dew-er.
Os cientistas da linha de raios lançam a coleta de dados, que pode ser seguida pelos usuários remotamente. Para cada tipo de amostra diferente, os usuários recebem um e-mail informando que a coleta de dados foi iniciada. A execução de todas as etapas em todos os fluxos de trabalho pode ser acompanhada online e em tempo real.
Isso é acessível ao usuário fazendo login no ISPyB. Os resultados também podem ser vistos e baixados. Para cada amostra analisada, examine os resultados do experimento automático no ISPyB.
Clique na sessão experimental desejada no ID30A1. Selecione o pipeline de processamento automático preferido. Baixe os dados escritos no grupo espacial correto com a maior completude e maior resolução.
Clicando nos últimos resultados de coleta e, em seguida, baixe. O fluxo de trabalho P de prensa MX foi usado pela linha de feixe ESRF Massive one para montar totalmente, centralizar o feixe de raios-X, caracterizar e coletar conjuntos de dados de difração completos de uma série de cristais de GCSH humanos. As amostras foram montadas e o laço analisado para uma área de varredura.
Após as análises de difração, foram selecionados quatro pontos dentro do cristal para coleta de dados. A determinação manual da estrutura por substituição molecular produziu um mapa de densidade eletrônica de alta qualidade após um único ciclo automatizado de refinamento. Para este conjunto de dados, o pipeline automatizado cortou os dados em uma resolução de um ponto três dois angstrom.
No entanto, os usuários podem decidir cortar os dados em uma resolução menor. A densidade eletrônica contínua é visível para toda a cadeia de aminoácidos além da tag histidina eterminal. Das quatro substituições que distinguem o GCSH humano e bovino, três são facilmente identificáveis na densidade eletrônica.
Isso é menos claro para o ácido aspartc à substituição de lisina 125. Para a qual a densidade eletrônica da cadeia lateral é apenas parcialmente resolvida devido à flexibilidade. O modelo atualmente obtido tem um valor de trabalho R de 20 pontos quatro por cento e um valor livre de R de 23 pontos oito por cento e pode ser ainda otimizado por ciclos adicionais de construção e refinamento de modelos automatizados e manuais.
É importante adequar os requisitos ao seu sistema. Por exemplo, definir a resolução já observada para um valor conhecido pode economizar tempo e garantir uma melhor coleta de dados. A coleta totalmente automática de dados democratizou a cristalografia e agora até mesmo pequenos laboratórios podem embarcar em projetos famosos quando isso era viável antes apenas com enorme poder de homem.
