El autor es un Reino Unido de Parkinson Research Fellow (subvención F1002). Este trabajo fue apoyado en parte por el Wellcome Trust / MRC convocatoria conjunta en la concesión de neurodegeneración (WT089698) al Consorcio de la Enfermedad de Parkinson del Reino Unido (UKPDC), cuyos miembros son del Instituto UCL de Neurología de la Universidad de Sheffield y la proteína MRC Unidad de Fosforilación en la Universidad de Dundee.

Seguridad El protocolo se describe a continuación utiliza ATP marcado con 32 P radiactivo en la posición del fosfato γ para seguir la actividad de la quinasa de LRRK2. Se basa en los protocolos estándar utilizados en nuestro laboratorio, y por lo tanto con respecto a muchos de los pasos en el proceso como la ejecución de los geles, el Western Blot et cetera los materiales y las condiciones precisas se debe tomar como guía los equipos y protocolos utilizados para estos procesos varían de un laboratorio a otro. Los compuestos que contienen isótopos que emiten radiaciones ionizantes son potencialmente dañinos para la salud humana y las licencias y regulaciones estrictas en un control de nivel institucional y nacional de su uso. Los experimentos en este protocolo se llevaron a cabo después del entrenamiento en el uso de radiación de la fuente abierta en el University College de Londres y siguiendo las directrices de buenas prácticas de laboratorio proporcionados por los servicios de seguridad en el colegio (directrices available en <a href="http://www.ucl.ac.uk/estates/safetynet/training/glp_hurs.pdf">http://www.ucl.ac.uk/estates/safetynet/training/glp_hurs.pdf</a> ). El uso de la radiación de código abierto no debe ser intentado antes de la formación adecuada y la aprobación regulatoria. El organismo regulador responsable de la radiación de fuentes abiertas en la investigación de laboratorio varía de país a país. Ejemplos de estos son: en el Reino Unido, la Health and Safety Executive ( <a href="http://www.hse.gov.uk/radiation/ionising/index.htm">http://www.hse.gov.uk/radiation/ionising/index.htm</a> ), en los Estados Unidos la Comisión Reguladora Nuclear ( <a href="http://www.nrc.gov/materials/miau/regs-guides-comm.html">http:// www.nrc.gov / materiales / miau / reglas-guías comm.html-</a> ), en Canadá la Comisión Canadiense de Seguridad Nuclear ( <a href="http://nuclearsafety.gc.ca/eng/">http://nuclearsafety.gc.ca/eng/</a> ), y en Alemania Das Bundesamt für Strahlenschutz ( <a href="http://www.bfs.de/de/bfs">http : / / www.bfs.de / de / BFS</a> ). Usuarios de otros países deben confirmar las reglas, los reglamentos y autoridades que otorgan licencias con el oficial de seguridad radiológica. Precauciones de seguridad pertinentes para este protocolo se han observado en el texto, resaltado con el símbolo del trébol radiactivo ( <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Símbolo de una" /> ). 1. Preparación de las reacciones de quinasa <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Símbolo de una" /> Todas las mezclas de reacción preparada en tubos de muestra de 1,5 ml con tapón de rosca que contiene una junta tórica para evitar la propagación de la radiactividad. <ol><li> Descongele la proteína en el hielo - LRRK2 de tipo salvaje, D1994A, G2019S. </li><li> constituyen una reacción en el hielo - 10 nM LRRK2, 0.5μg/μl MBP, 5UL de tampón quinasa 10X, compuesto de 50μl con agua. </li></ol> 2. Al realizar el análisis <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Símbolo de una" /> Todos los pasos que utilizan 32 P ATP debe tomar pencaje en las áreas designadas de radiación. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Símbolo de una" /> Equipo de protección personal se debe usar - en un procedimiento operativo estándar en nuestro laboratorio que incluyen bata de laboratorio, guantes dobles y gafas protectoras. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Símbolo de una" /> Las muestras que contienen 32 P ATP debe ser protegido de los usuarios de pantallas de metacrilato de 6 mm para minimizar la exposición. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Símbolo de una" /> Cuando se utilicen dispositivos de aplicación, el seguimiento personal debe ser utilizado - en la UCL, cualquier certificado de usuario abierta la radiación de origen debe tener una placa de cine para monitorear exposición a la radiación durante los experimentos. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Símbolo de una" /> Todas las superficies experimentales se debe evaluar la contaminación radiactiva antes y después de su uso mediante un Geiger contra. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Símbolo de una" /> Todos los consumibles potencialmente contaminados deben ser eliminados en estricto apego a las directrices institucionales para la eliminación de los residuos radiactivos. <ol><li> Antes de comenzar la prueba, establecer bloques de calentamiento a 30 ° C y 100 ° C, respectivamente, </li><li> Retire 32 P ATP a partir de congelador a -20 (tenga en cuenta que las condiciones de almacenamiento de aquí para allá 32 P ATP puede variar en función de proveedor o el tipo de radionucleótidos se utiliza). <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Símbolo de una" /> exploración fuera del contenedor antes de su uso, descongelar detrás de la pantalla de metacrilato. </li><li> Con las reacciones en el hielo, añadir 1μl de 32 P ATP a cada junto con 10μM de ATP frío. </li><li> Mezclar bien con la pipeta. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Símbolo de una" /> Centrífuga de pulso para llevar líquido a la parte inferior del tubo, reduciendo al mínimo el riesgo de contaminación. </li><li> Quitar alícuota 15μl de punto cero del tiempo unad terminar la reacción de parte alícuota de la adición de 5μl de tampón de muestra SDS 4x y desnaturalización a 100 ° C durante 10 minutos. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Símbolo de una" /> Centrífuga de pulso para llevar líquido a la parte inferior del tubo, reduciendo al mínimo el riesgo de contaminación. </li><li> Resto de la muestra colocada en el bloque de calentamiento y se incuba a 30 ° C durante 60 minutos. </li><li> 15μl retirado a los 60 minutos de tiempo y punto de terminar la reacción mediante la adición de 5μl de tampón de muestra SDS 4x y desnaturalización a 100 ° C durante 10 minutos. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Símbolo de una" /> Centrífuga de pulso para llevar líquido a la parte inferior del tubo, reduciendo al mínimo el riesgo de contaminación. </li></ol> 3. Inmunotransferencia las muestras y el análisis de los resultados <ol><li> Muestras analizadas por SDS-PAGE <ol><li> 10 y 12.4% Bis-Tris gel de poliacrilamida preparados para electroforesis con buffer MOPS funcionamiento. </li><li> 20μl de cada muestra cargada en gel junto con 7μl de objetos punzantesmantener escalera cantidad estándar de proteínas. </li><li> Gel funcionar a 160V durante 90 minutos, o hasta que frente tinte ha llegado al final del gel. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Símbolo de una" /> Todo el líquido en contacto con radioisótopos deben ser tratados como residuos radiactivos y eliminados de las directrices institucionales de acuerdo. Regulaciones estatales UCL que los residuos radiactivos líquidos deben ser desechados mediante el vertido de abajo designado fregaderos de desechos radiactivos con abundante agua. </li></ol></li><li> Proteínas transferidas a una membrana de PVDF a través de Western blot. <ol><li> Tampón de transferencia preparada, 1x Tris glicina y un 20% de metanol. Membrana de PVDF y papel de filtro cortado al tamaño correcto para el gel y se activa con metanol de los glaciares en el caso de la membrana o humedecer previamente con tampón de transferencia en el caso del papel de filtro. La membrana debe ser pre-marcado con tinta de bolígrafo para permitir la identificación de la orientación. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Símbolo de una" /> Gel retirado de plastIC carcasa y el exceso de acrilamida retirados y eliminados como residuo radiactivo. </li><li> El gel debe ser formado en un sándwich con la membrana y el papel de filtro, asegurando que no existen burbujas entre la membrana y el gel, y luego dispuestos en el aparato de Western blot con la membrana entre el gel y el ánodo. </li><li> Transferencia realizada a 25V durante 16 horas. </li></ol></li><li> Después de la transferencia de proteínas a PVDF, la membrana se debe secar a temperatura ambiente. Finalmente, la membrana en seco deben ser aislados entre las hojas de acetato de celulosa y se expone a cualquiera de una pantalla de fósforo o de película de rayos X para permitir la detección de la proteína marcada radiactivamente. Tiempo de exposición puede ejecutar de varias horas a más de una semana dependiendo de la actividad específica del radioisótopo utilizado y la cinética enzimática de la reacción. </li><li> Phosphoscreen escaneados / película procesada. Si se utiliza una pantalla de fósforo, la imagen debe ser guardado como un archivo TIFF de alta resolución o un archivo de mapa de bits, si se utiliza película entonces la resultante transiciónsparency deben ser escaneados con un escáner de escritorio y guarda como un archivo TIFF de alta resolución o un archivo de mapa de bits. La imagen puede ser analizada en ImageJ, un programa gratuito disponible en el sitio web de los Institutos Nacionales de Salud ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ). </li></ol> 4. Resultados representante La figura 1 muestra los resultados representativos de un ensayo llevado a cabo utilizando el tipo salvaje, y LRRK2 G2019S D1994A con proteína básica de mielina como sustrato aceptor de fosfato de genéricos. Autofosforilación de LRRK2 es visible en ≈ 200kDa, con múltiples bandas que representan a MBP fosforilada visible a partir del 20-40kDa. Nótese la ausencia de autofosforilación en el D1994A (quinasa muertos) de carril, y el aumento de la fosforilación debido a la mutación G2019S. Tenga en cuenta también la fosforilación de residuos de MBP en el carril de muertos quinasa. Esto puede ser debido a la ablación incompleta de la actividad quinasa de LRRK2 por el mutante D1994A o reflejar la presencia of rastro contaminante quinasas en la reacción. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1.

<ol>
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No hay conflictos de interés declarado.

Este documento describe un protocolo básico para el ensayo de la actividad quinasa de LRRK2 usando un sistema in vitro. En aras de la brevedad, este se ha limitado a una plantilla final de una hora con un punto de sustrato genérico, pero el protocolo general es aplicable a una amplia gama de sustratos potenciales y susceptibles de análisis más sofisticados examinar la cinética de la actividad quinasa de LRRK2 . Esto pone de relieve una de las principales ventajas de la utilización de un sistema in vitro para examinar el comportamiento de una proteína quinasa, como esta: porque no hay un control completo sobre las concentraciones de la enzima y el sustrato, es posible generar los datos de cinética y calcular la K m V y los valores máximos para la reacción. Para las evaluaciones más detalladas cinética o evaluar el impacto de los inhibidores putativos, un sistema de mayor rendimiento (como la que ofrece el uso del sustrato LRRKtide, disponible en Invitrogen), es un espléndido alternative al método descrito aquí. Es importante, sin embargo, reconocer que el sistema proporcionado por el modelo reduccionista en los ensayos de quinasa in vitro no es más que una herramienta para examinar la biología de una quinasa y sus relaciones con los posibles sustratos. Los datos de los ensayos de este tipo se debe utilizar en combinación con otros métodos para obtener un cuadro completo de cómo se comporta una quinasa in vitro y en un contexto celular. Por ejemplo, un sustrato putativo fosforilada in vitro pueden ser analizados por espectrometría de masas para identificar phosphosites posible que luego pueden ser manipulados por mutagénesis dirigida (por ej. Serina treonina o la conversión de los residuos de aceptor de fosfato de phosphorylatable no-residuos como la alanina) para examinar el funcionamiento consecuencias de la ex vivo fosforilación. Una consideración clave en la interpretación de los datos de un sistema de ensayo in vitro de este tipo es la probabilidad de either de tipo I o tipo II (falsos positivos o falsos negativos) errores. La naturaleza reduccionista de este sistema por desgracia, dispone de dos - en el caso de la primera, tiene un sustrato purificada putativo y purificada quinasa muy cerca artificialmente y en alta concentración (en comparación con el medio celular) puede dar lugar a eventos de fosforilación artefacto. Por el contrario, muchas quinasas funcionan como parte de un complejo en el contexto de la célula, y requieren de cofactores para la fosforilación de un sustrato dado que se produzca. Como se señaló anteriormente, un resultado positivo de la fosforilación de un sustrato supuesto usando un sistema de ensayo in vitro se debe probar en un sistema celular para validar el resultado, y un resultado negativo debe ser interpretado con cautela. En vista de ello, es fundamental que sea posible la realización de controles positivos y negativos para permitir un estudio comparativo de la actividad de la quinasa de interés. La selección cuidadosa de un contro positivol que tiene una actividad conocida a la proteína de interés, junto con un control negativo que es poco probable que fosforilan el sustrato putativo, es extremadamente valioso. Un candidato para el control de LRRK2 es la interacción del receptor quinasa 3, que tiene una secuencia estrechamente relacionados con el principal dominio de la quinasa LRRK2 pero tiene una estructura global de dominio muy diferente 18. Esto está disponible como proteína recombinante de Invitrogen y se utiliza como un control estándar en nuestro laboratorio. También hay que señalar que la forma comercial de LRRK2 carece de la N-terminal de la proteína y se etiqueta con glutatión-s-transferasa y esto debe ser tenido en cuenta como posible factor de confusión en la realización de ensayos con esta proteína quinasa, ya que no se sabe cuál es el papel de la N-terminal de LRRK2 pueden desempeñar en la función normal de esta proteína. Si, por ejemplo, la porción N-terminal de LRRK2 que está ausente en la proteína usada en este protocoloes fundamental para la contratación de un sustrato específico para el dominio quinasa de LRRK2 entonces esto tendrá un impacto importante en la fosforilación observados de dicho sustrato en el sistema in vitro se ha descrito anteriormente. Aun con estas salvedades, sin embargo, la importancia que tiene la biología de LRRK2 en la investigación de Parkinson destaca la utilidad de este protocolo como una herramienta valiosa para investigar el comportamiento de esta proteína en un entorno en vitro.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentario </td></tr><tr><td> LRRK2 de tipo salvaje </td><td> Invitrogen </td><td> PV4873 </td><td></td></tr><tr><td> LRRK2 G2019S </td><td> Invitrogen </td><td> PV4881 </td><td></td></tr><tr><td> LRRK2 D1994A </td><td> Invitrogen </td><td> PV6051 </td><td></td></tr><tr><td> Quinasa buffer </td><td> Señalización Celular </td><td> 9802S </td><td></td></tr><tr><td> MBP </td><td> Sigma </td><td> M1891 </td><td></td></tr><tr><td> G 32P ATP </td><td> Perkin Elmer </td><td> BLU002X500UC </td><td> 500μCi, 30Ci / mmol </td></tr><tr><td> 4x LDS tampón de muestra </td><td> Invitrogen </td><td> NP0007 </td><td></td></tr><tr><td> 2-mercaptoetanol </td><td> Sigma </td><td> M6250 </td><td></td></tr><tr><td> Normas de la proteína </td><td> Invitrogen </td><td> LC5800 </td><td></td></tr><tr><td> MOPS funcionamiento de amortiguación </td><td> InvitrOgen </td><td> NP0001 </td><td></td></tr><tr><td> Bis-Tris gel de acrilamida </td><td> Invitrogen </td><td> NP0321 </td><td> 12.4% de 1 mm 10well </td></tr><tr><td> Membrana de PVDF </td><td> Millipore </td><td> IPVH00010 </td><td></td></tr><tr><td> Transferencia de buffer </td><td> Invitrogen </td><td> NP0006 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 1. Reactivos Destilada y agua desionizada se utiliza para todas las etapas de dilución <table border="1"><tbody><tr><td> Tipo de equipo </td><td> Empresa </td><td> Comentario </td></tr><tr><td> Contador Geiger </td><td> Mini Instrumentos </td><td></td></tr><tr><td> SDS-PAGE tanque </td><td> Invitrogen </td><td></td></tr><tr><td> Transferencia de tanque </td><td> Invitrogen </td><td></td></tr><tr><td> Bloquea el calor (2) </td><td> Eppendorf </td><td></td></tr><tr><td> Pantalla de fósforo </td><td> GE </td><td> Película de rayos X puede ser sustituido </td></tr><tr><td> Fósforo iMager </td><td> GE </td><td></td></tr><tr><td> La exposición de cassette </td><td> GE </td><td></td></tr><tr><td> Centrífugo </td><td> Eppendorf </td><td></td></tr><tr><td> Perspex blindaje </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tubos de 1,5 ml </td><td> VWR </td><td> Con tapa de rosca con junta tórica </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Equipo

assaying the kinase activity of lrrk2 in vitro

Quinasa con repeticiones ricas en leucina 2 (LRRK2) es un miembro de 2,527 aminoácidos de la familia ROCO de las proteínas, que poseen una estructura compleja, con varios dominios como un dominio GTPasa (llamado ROC, por Ras de proteínas complejas) y un dominio kinasa 1. El descubrimiento en 2004 de las mutaciones en el LRRK2 que causan la enfermedad de Parkinson (EP) resultó en LRRK2 ser el centro de un enorme volumen de investigación sobre su función normal y cómo la proteína va mal en el estado de la enfermedad 2,3. Las investigaciones iniciales sobre la función de LRRK2 se centró en su actividad enzimática 4-6. A pesar de un panorama claro todavía tiene que emerger de una alteración consistente en estos debido a las mutaciones, los datos de un número de grupos ha puesto de relieve la importancia de la actividad quinasa de LRRK2 en la muerte celular vinculados a las mutaciones 7,8. Publicaciones recientes han descrito inhibidores de la orientación de la actividad quinasa de LRRK2, proporcionando una herramienta clave experimental 9-11. A la luz de estos datos,Es probable que las propiedades enzimáticas de LRRK2 nos ofrecen una ventana importante en la biología de esta proteína, aunque si son blancos potenciales de medicamentos para el Parkinson está abierto a debate. Una serie de enfoques diferentes se han utilizado para analizar la actividad quinasa de LRRK2. Inicialmente, los ensayos se llevaron a cabo utilizando la proteína epítopo etiquetados sobreexpresado en líneas celulares de mamíferos y immunoprecipitated, con los ensayos realizados con esta proteína inmovilizada en bolas de agarosa 4,5,7. Posteriormente, se purifica fragmentos recombinantes de LRRK2 en la solución también se han utilizado, por ejemplo, un fragmento de etiquetado GST purificada de células de insectos que contengan residuos de 970 a 2527 de 12 LRRK2. Recientemente, Daniels et al. Reportó el aislamiento de LRRK2 de larga duración en solución a partir de células embrionarias de riñón, sin embargo esta proteína no está ampliamente disponible 13. Por el contrario, la fusión GST truncado forma de LRRK2 es comercialmente dise (de Invitrogen, véase el cuadro 1 para más detalles), y proporciona una herramienta útil para la demostración de un ensayo para la actividad de la quinasa LRRK2. Diferentes productos de la actividad quinasa LRRK2 se han reportado. Autofosforilación de LRRK2 en sí, la fosforilación de la proteína básica de mielina (MBP) como sustrato de quinasa genéricos y la fosforilación de un sustrato artificial - LRRKtide llamada, basado en la fosforilación de treonina 558 en Moesin - se han utilizado, al igual que una serie de supuestos sustratos fisiológicos incluyendo α-sinucleína, Moesin y 4-EBP 14-17. El estado de estas proteínas como sustratos para LRRK2 aún no está claro, y como tal, el protocolo descrito a continuación se centrará en el uso de MBP como sustrato genérico, teniendo en cuenta la utilidad de este sistema de ensayo de actividad de la quinasa LRRK2 contra una amplia gama de sustratos potenciales.

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Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Quinasa con repeticiones ricas en leucina 2 es una quinasa multidominio grandes, las mutaciones en el que son la causa genética más común de enfermedad de Parkinson. Análisis de la actividad quinasa de la proteína ha demostrado ser una herramienta crucial en la comprensión de la biología y la disfunción de esta proteína. En este trabajo,<em&gt; In vitro</em&gt; Ensayo de la actividad quinasa de LRRK2 y una selección de sus mutantes se describe, proporcionando un sistema experimental para estudiar la fosforilación de sustratos putativo y la disfunción potencial de LRRK2 en la enfermedad.

Ensayo de la actividad quinasa de LRRK2 In vitro</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a ...

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Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

22.5K vistas.  UCL Institute of Neurology. Quinasa con repeticiones ricas en leucina 2 es una quinasa multidominio grandes, las mutaciones en el que son la causa genética más común de enfermedad de Parkinson. Análisis de la actividad quinasa de la proteína ha demostrado ser una herramienta crucial en la comprensión de la biología y la disfunción de esta proteína. En este trabajo, In vitro Ensayo de la actividad quinasa de LRRK2 y una selección de sus mutantes se describe, proporcionando un...

Video: Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Assaying the Ability of Diffusible Signaling Molecules to Reorient Embryonic Spinal Commissural Axons

Dorsal commissural axons in the vertebrate spinal cord1 have been an invaluable model system in which to identify axon guidance signals. Here, we describe an in vitro assay, "the reorientation assay", that has been used extensively to study the effect of extrinsic and intrinsic signals on the orientation of commissural axons2. This assay was developed by numerous people in the laboratories of Jane Dodd, Thomas Jessell and Andrew Lumsden (see acknowledgements for more details) and versions of this assay were used to demonstrate the reorientation activities of key axon guidance molecules, including the BMP chemorepellent in the roof plate3,4 and the chemoattractive activities of Netrin15 and Sonic Hedgehog (Shh)6 in the floor plate in the spinal cord.
Explants comprising 2-3 segments of the dorsal two-thirds of spinal cord are dissected from embryonic day (E) 11 rats and cultured in three dimensional collagen gels7. E11 dorsal spinal explants contain newly born commissural neurons, which can be identified by their axonal expression of the glycoprotein, Tag18. Over the course of 30-40 hours in culture, the commissural axon trajectory is recapitulated in these dorsal explants with a time course similar to that seen in vivo. This axonal trajectory can be challenged by placing either test tissues or a COS cell aggregate expressing a candidate signaling molecule in contact with one of the lateral edges of the dorsal explant. Commissural axons extending in the vicinity of the appended tissue will grow under the influence of both the endogenous roof plate and signals from the ectopic lateral tissue. The degree to which commissural axons are reoriented under these circumstances can be quantified. Using this assay, it is possible both to examine the sufficiency of a particular signal to reorient commissural axons3,4 as well the necessity for this signal to direct the commissural trajectory9.

This assay assesses the ability of a signaling molecule, here Bone Morphogenetic Protein 7 (BMP7), to reorient commissural axons. An explant of embryonic dorsal spinal cord is cultured adjacent to an aggregate of COS cells secreting the candidate growth factors. Reoriented commissural axons growing within the explant are visualized by immunohistochemistry.

Ensayo de la capacidad de difusible moléculas de señalización para reorientar embrionarias axones de la comisura espinal

Dorsal commissural axons in the vertebrate spinal cord1 have been an invaluable model system in which to identify axon guidance signals.  Here, we ...

Investigación

Biología

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

En la reconstitución in vitro de los activos T. castaneum telomerasa

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such probes typically consist of variants of CFP and YFP, intervened by a phosphorylatable sequence and a phospho-binding domain. Upon phosphorylation, the probe changes conformation, which results in a change of the distance or orientation between CFP and YFP, leading to a change in FRET efficiency (Fig 1). Several probes have been published during the last decade, monitoring the activity balance of multiple kinases and phosphatases, including reporters of PKA2, PKB3, PKC4, PKD5, ERK6, JNK7, Cdk18, Aurora B9 and Plk19. Given the modular design, additional probes are likely to emerge in the near future10. 
Progression through the cell cycle is affected by stress signaling pathways 11. Notably, the cell cycle is regulated differently during unperturbed growth compared to when cells are recovering from stress12.Time-lapse imaging of cells through the cell cycle therefore requires particular caution. This becomes a problem particularly when employing ratiometric imaging, since two images with a high signal to noise ratio are required to correctly interpret the results. Ratiometric FRET imaging of cell cycle dependent changes in kinase and phosphatase activities has predominately been restricted to sub-sections of the cell cycle8,9,13,14.
Here, we discuss a method to monitor FRET-based probes using ratiometric imaging throughout the human cell cycle. The method relies on equipment that is available to many researchers in life sciences and does not require expert knowledge of microscopy or image processing.

FRET-based reporters are increasingly used to monitor kinase and phosphatase activities in live cells. Here we describe a method on how to use FRET-based reporters to assess cell cycle-dependent changes in target phosphorylation.

Seguimiento de las actividades de quinasa y fosfatasa través del ciclo celular por Proporcional FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such ...

Direct Detection of the Acetate-forming Activity  of the Enzyme Acetate Kinase

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of acetate to acetyl phosphate utilizing ATP as a substrate. Acetate kinases are ubiquitous in the Bacteria, found in one genus of Archaea, and are also present in microbes of the Eukarya6. The most well characterized acetate kinase is that from the methane-producing archaeon Methanosarcina thermophila7-14. An acetate kinase which can only utilize PPi but not ATP in the acetyl phosphate-forming direction has been isolated from Entamoeba histolytica, the causative agent of amoebic dysentery, and has thus far only been found in this genus15,16.
In the direction of acetyl phosphate formation, acetate kinase activity is typically measured using the hydroxamate assay, first described by Lipmann17-20, a coupled assay in which conversion of ATP to ADP is coupled to oxidation of NADH to NAD+ by the enzymes pyruvate kinase and lactate dehydrogenase21,22, or an assay measuring release of inorganic phosphate after reaction of the acetyl phosphate product with hydroxylamine23. Activity in the opposite, acetate-forming direction is measured by coupling ATP formation from ADP to the reduction of NADP+ to NADPH by the enzymes hexokinase and glucose 6-phosphate dehydrogenase24.
Here we describe a method for the detection of acetate kinase activity in the direction of acetate formation that does not require coupling enzymes, but is instead based on direct determination of acetyl phosphate consumption. After the enzymatic reaction, remaining acetyl phosphate is converted to a ferric hydroxamate complex that can be measured spectrophotometrically, as for the hydroxamate assay. Thus, unlike the standard coupled assay for this direction that is dependent on the production of ATP from ADP, this direct assay can be used for acetate kinases that produce ATP or PPi.

A method for the determination of acetate kinase activity is described. This assay utilizes a direct reaction for determining enzyme activity and kinetics of acetate kinase in the acetate-forming direction with different phosphoryl acceptors. Furthermore, this method can be utilized for assaying other acetyl phosphate or acetyl-CoA utilizing enzymes.

La detección directa de la actividad de acetato de formación de la enzima cinasa de acetato

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of ...

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures of polypeptides fulfill many purposes, it is now recognized that most proteins can adopt an alternative assembly of beta-sheet rich amyloid. Insoluble amyloid fibrils are initially associated with multiple human ailments, but they are increasingly shown as functional players participating in various important cellular processes. In addition, amyloid deposited in patient tissues contains nonproteinaceous components, such as nucleic acids and glycosaminoglycans (GAGs). These cofactors can facilitate the formation of amyloid, resulting in the generation of different types of insoluble precipitates. By taking advantage of our understanding how proteins misfold via an intermediate stage of soluble amyloid precursor, we have devised a method to convert native proteins to amyloid fibrils in vitro. This approach allows one to prepare amyloid in large quantities, examine the properties of amyloid generated from specific proteins, and evaluate the structural changes accompanying the conversion.

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins can either adopt a native structure or misfold into insoluble amyloid. Conditions that favor the misfolding pathway lead to the formation of different types of amyloid fibrils. The methods described here allow rapid conversion of native proteins into amyloid in vitro.

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures ...

Assaying Proteasomal Degradation in a Cell-free System in Plants

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular functions in virtually all eukaryotic organisms. Specifically, in plants, the ubiquitin/26S proteasome system (UPS) regulates protein degradation and contributes significantly to development of a wide range of processes, including immune response, development and programmed cell death. Moreover, increasing evidence suggests that numerous plant pathogens, such as Agrobacterium, exploit the host UPS for efficient infection, emphasizing the importance of UPS in plant-pathogen interactions.
The substrate specificity of UPS is achieved by the E3 ubiquitin ligase that acts in concert with the E1 and E2 ligases to recognize and mark specific protein molecules destined for degradation by attaching to them chains of ubiquitin molecules. One class of the E3 ligases is the SCF (Skp1/Cullin/F-box protein) complex, which specifically recognizes the UPS substrates and targets them for ubiquitination via its F-box protein component. To investigate a potential role of UPS in a biological process of interest, it is important to devise a simple and reliable assay for UPS-mediated protein degradation. Here, we describe one such assay using a plant cell-free system. This assay can be adapted for studies of the roles of regulated protein degradation in diverse cellular processes, with a special focus on the F-box protein-substrate interactions.

Targeted protein degradation represents a major regulatory mechanism for cell function. It occurs via a conserved ubiquitin-proteasome pathway, which attaches polyubiquitin chains to the target protein that then serve as molecular &#8220;tags&#8221; for the 26S proteasome. Here, we describe a simple and reliable cell-free assay for proteasomal degradation of proteins.

Ensayo Proteasomal degradación en un sistema libre de células en las plantas

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

Reconstitución funcional y la actividad del canal Las mediciones de Purificada Wildtype y mutante CFTR Proteína

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This protocol repurposes an instrument often used to measure adult activity, the TriKinetics Drosophila activity monitor (MB5 Multi-Beam Activity Monitor) to study larval activity. The instrument can monitor the movements of animals in 16 individual 8 cm glass assay tubes, using 17 infrared detection beams per tube. Logging software automatically saves data to a computer, recording parameters such as number of moves, times sensors were triggered, and animals&#8217; positions within the tubes. The data can then be analyzed to represent overall locomotion and/or position preference as well as other measurements. All data are easily accessible and compatible with basic graphing and data manipulation software. This protocol will discuss how to use the apparatus, how to operate the software and how to run a larval activity assay from start to finish.

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

This report describes a method for measuring Drosophila larval activity using the TriKinetics Drosophila Activity Monitor. The device employs infrared beams to detect movements of up to 16 individual animals. Data can be analyzed to represent motion parameters including rates and the positions of the animals within the assay chambers.

La medición de las larvas La actividad en el<em&gt; Drosophila</em&gt; Monitor de Actividad

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

Identificación de los pares quinasa-sustrato Usando selección de alto rendimiento


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from S-adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine, monomethyl-phosphatidylethanolamine, or dimethyl-phosphatidylethanolamine to give either monomethyl-phosphatidylethanolamine, dimethyl-phosphatidylethanolamine or phosphatidylcholine. These enzymes are ubiquitous in animal cells, fungi, and are also found in approximately 10% of bacteria. They fulfill various important functions in cell physiology beyond their direct role in lipid metabolism such as in insulin resistance, diabetes, atherosclerosis, cell growth, or virulence. The present manuscript reports on a simple cell-free enzymatic assay that measures the transfer of tritiated methyl group(s) from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine using whole cell extracts as an enzyme source. The resulting methylated forms of phosphatidylethanolamine are hydrophobic and thus, can be separated from water soluble S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine by organic extraction. This assay can potentially be applied to any other cell types and used to test inhibitors/drugs specific to a phosphatidylethanolamine methyltransferase of interest without the need to purify the enzyme.

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

The present report describes an in vitro enzymatic assay to measure phosphatidylethanolamine methyltransferase activity using Leishmania cell extracts. This assay is based on the transfer of a radioactive methyl group from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto endogenous phosphatidylethanolamine.

Methods Article

Ensayo de la actividad quinasa de LRRK2 In vitro