Внеклеточные пузырьки все чаще используются в качестве диагностического биомаркера и потенциального терапевтического инструмента во многих областях. Flow Cytometric является наиболее прямой вперед аналитический метод для характеристики костюма сталкиваются маркеры этот протокол может быть использован при анализе assized частицы, быстро, и применимо к обычным сейсмометры без необходимости специальной настройки или выделенный инструмент. Хотя этот протокол используется для классификации внеклеточных пузырьков от сказал условие и среды, она может быть расширена в направлении классификации крови прибыл AVs, чтобы заменить инвазивных биопсий тканей у пациентов.
Для исследователей, новых к протоколу, очень важно выполнить шаги, описанные в разделе метода настройки, и внимательно следить за продемонстрированы стратегии получения Начать путем покрытия 55 сантиметров в квадрате Петри-блюда с 02%porcine кожи желатина, в PBS. Через 15 минут, мыть блюдо и пластины 4,4 раза 10 до пятого сердечного прародителя клетки на каждое блюдо в 7 миллилитров Iscove в модифицированных Dulbecco's Medium, или IMDM, дополненный 20%fetal сыворотки крупного рогатого скота, и 1%пенициллин и стрептомицин для их инкубации при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа. Когда клетки достигают около 80% слияния, мыть культуры в два раза с PBS Дулбекко без кальция и магния и кормить клетки с 10 milileters сыворотки свободной экзосомы производства среды.
Через 7 дней с каждой пластины сгустите кондиционированную среду в единую полипропиленовую центрифугу и центрифугу для удаления любого клеточного мусора. Перенесите супернатент в 100-килодальтонную центрифугу фильтровальной трубки, и сосредоточьте очищенную, кондиционированную, среду с дополнительной центрифугой. Перенесите концентрат в трубку микроцентрифуги для окончательной центрифугации скамейки и добавьте супернатант в поликарбонатную толстую стенку микроцентрифугной трубки.
Заполните трубку PBS, до конечного объема 3,2 milileters, и загрузить образец в титановый фиксированный ангельский ротор. Затем загрузите ротор в настольный ультрацентрифуг для ультрацентрифугации и повторно насадите гранулы в 100 микролитров свежего PBS. Для отслеживания и анализа наночастиц количественно, разбавить 1 микролитр ультрацентрифугированного образца, в 999 микролитров PBS, и загрузить образец в 1 миллилет шприц без пузырьков.
Загрузите шприц в входный порт экзаменационной камеры и включите лазер. Используйте кнопку захвата, чтобы открыть камеру и настроить фокус. Затем завемить по крайней мере три различных кадра по 60 секунд каждый и использовать опцию пакетного процесса в программном обеспечении, чтобы проанализировать три различных приобретения.
Чтобы подготовить образец к приобретению, сначала добавьте соответствующие экспериментальные моноклональные антитела, конъюгированные бусинки захвата в соотношении 1:1:1, в микроцентрифугу трубки, и вихрь в результате захвата бисера бассейн. Далее добавьте соответствующий объем выборки к 1 микролитеру пула бусинки захвата для генерации 1 раза от 10 до 8 частиц плюс 1,2 раза от 10 до 5 бусин на тестовую концентрацию. Добавьте 1 микролитер из бисера в трубку с маркировкой бисера как отрицательный контроль, и отрегулируйте громкость в каждой трубке до 100 микролитров со свежим PBS.
Затем поместите трубки в термомешалке, с встряхивания, на 400 оборотов в минуту, и от 4 до 10 по Цельсию, на ночь. На следующий день, передать образцы на круглое дно 96 хорошо пластины, и добавить соответствующие florescence конъюгированных антител к каждому хорошо. После 1 часа инкубации при 4 до 10 градусов по Цельсию, добавить 100 микролитров PBS к каждой хорошо, и открыть приобретение программного обеспечения.
Выберите цитометр и систему запуска программы, чтобы начать инструмент и открыть новый эксперимент. Создайте экспериментальный шаблон, выберите пластину и добавьте пластину. Выберите положение образцов на пластине, и нажмите набор, а также образец.
Введите имя образца в правилах именования, откройте вкладку канала и выберите соответствующие каналы сигнала флорескции. Теперь загрузите пластину в инструмент. И нажмите точка участок, чтобы создать новую область рассеяния вперед по сравнению с боковой области рассеяния точка участка.
Выберите инициализировать, чтобы начать лазер и fluidics и нажмите запустить, чтобы начать приобретение. Отрегулируйте шкалу, чтобы показать население в середине вперед по сравнению с боковой участок рассеяния, и сделать бисер ворота вокруг всей популяции выборки, чтобы исключить мусор. Нажмите стоп и точка участок для создания вперед рассеяния высоты по сравнению с вперед рассеяния области точка участка, и ворота образца на бисер населения.
Нарисуйте новые ворота вокруг большего населения и назовите его Singlets, и нажмите точка участок, чтобы создать один флуоресцентный сигнал по сравнению с боковой рассеяния области точка участка, в экспериментальном флюорофор используется. Ворота новый участок точка на Singlets. Затем выберите количество событий для записи и выберите запись для начала экспериментального приобретения.
В конце анализа загрузите файлы приобретения в соответствующее программное обеспечение для анализа и откройте новый протокол. Создайте точечные участки для каждого файла, как только что продемонстрировано, и установите всю ось рассеяния в линейную шкалу, и все флуоресцентные оси для шкалы журнала. Затем покажите геометрическое значение флоресции в соответствующих каналах сигналов, чтобы рассчитать полное изменение среднего интенсивности флорескции, в различных внеклеточных препаратах везикулы.
После тестирования различных условий, чтобы установить минимальное общее количество внеклеточных пузырьков, чтобы достичь ранней экспоненциальной фазы кривой интенсивности среднего флуоресценции, минимальное количество частиц было определено в 1 раз от 10 до 8 частиц на окрашивание. Оптимальная концентрация антител в 1 раз от 10 до 8 частиц для достижения наивысшего сигнала без связывания неспецифических антител, была определена как 10 микрограмм на миллилитр как для анти-CD9_FITC и анти-CD63_PE антител и пять микрограмм на миллилитр для анти CD81_PE антитела. Чтобы подтвердить пригодность метода, для анализа чашки формы внеклеточных пузырьков, а не мембранного мусора, внеклеточные пузырьки были sonicated, в результате чего снижение среднего флуоресценции интенсивности, после всего лишь 30 секунд sonication, без флорескции обнаружены на всех после одной минуты механического нарушения.
Собственная очистка X от клеток-предшественников сердца, как было продемонстрировано, дает внеклеточные пузырьки, выражая низкий уровень CD9 и высокий уровень CD63 и CD81 у обеих популяций клеток. Кроме того, в то время как собственные маркеры поверхности X четко идентифицируются без ультрацентрифугации, этот шаг обогащения значительно повышает средняя интенсивность флуоресценции этих маркеров. При работе с внеклеточными пузырьками, есть более небрежные гранулы наночастицы могут быть легко пропущены.
Поэтому необходимо следовать всем шагам, как это попродемонстрировано в протоколе. Использование внеклеточных пузырьков в качестве биомаркера в настоящее время является одним из самых новых полевых исследований. И в скором времени, может быть переведен в клинической диагностики используется в качестве альтернативного инструмента скрининга.
