Este protocolo permite garantizar un buen aislamiento de las vesículas extracelulares y la notificación de un mayor número de proteínas EBDF. En comparación con otras técnicas de aislamiento, ésta sostiene que es más integridad y actividades verticales. Los vehículos eléctricos se están estudiando cada vez más en LC, así como en condiciones patológicas.
Este método se puede aplicar a cualquier sistema que elijamos para caracterizar y estudiar los vehículos eléctricos. Para ese contenido o la ética biológica se requiere especial atención al iterar vehículos eléctricos, ya que en la cultura resulta en los siguientes experimentos. Una demostración visual es fundamental para albergar equipos específicos, como una columna de cromatografía de exclusión de tamaño casero, así como la participación del contador de nanopartículas y el espectrómetro de masas.
Ayudar a demostrar el procedimiento será Antonella Raffo-Romero, una del laboratorio. Comience por pre-aislar las vesículas extracelulares, o VEHÍCULOs eléctricos, desde el medio de condición. Transfiera la condición al medio de cultivo de cultivos de microglia o macrófagos a un tubo cónico y centrifugarlo a 1.200 veces G durante 10 minutos para peletizar las células.
Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo cónico y centrífuga durante otros 20 minutos para eliminar los cuerpos apoptóticos. A continuación, transfiera el sobrenadante a un tubo de policarbonato de 10,4 mililitros. Coloque el tubo en un rotor de 70,1 TI y una centrífuga ultra a 100.000 veces G durante 90 minutos a cuatro grados centígrados para peletizar los vehículos eléctricos.
Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y resusppend el pellet en 200 microlitros de 0,2 micrómetros de PBS filtrado. Para aislar los vehículos eléctricos, prepare una columna de cromatografía de exclusión de tamaño casera lavando y esterilizando una columna de cromatografía de vidrio, y colocando un filtro de 60 microlitrotros en la parte inferior. Apilar la columna con matriz base de filtración de gel de agarosa reticulada para crear una fase estacionaria de 0,6 centímetros de diámetro y 20 centímetros de altura.
A continuación, enjuague la fase con 50 mililitros de 0,2 micrometros de PBS filtrado. Si es necesario, guarde la columna a cuatro grados centígrados para su uso posterior. Coloque el pellet EV resuspendido en la parte superior de la fase estacionaria y recoja 20 fracciones secuenciales de 250 microlitros mientras continúa agregando PBS a la parte superior de la fase estacionaria.
Las fracciones se pueden almacenar a menos 20 grados centígrados. Para realizar un análisis de seguimiento de nanopartículas, realice una dilución de cada fracción con 0,2 micrómetros de PBS filtrado y vórtice para eliminar agregados. Coloque la solución en una jeringa de un mililitro y colóquela en la bomba de jeringa automatizada.
A continuación, ajuste la configuración de la cámara al nivel de ganancia de pantalla y el nivel de cámara adecuados y haga clic en Ejecutar. Cargue la muestra en la cámara de análisis con una velocidad de perfusión de 1000 durante 15 segundos. A continuación, disminuya y estabilice el flujo de velocidad para la grabación de vídeo a una velocidad de perfusión de 25 durante 15 segundos.
Captura tres videos consecutivos de 60 segundos del flujo de partículas. A continuación, ajuste el nivel de la cámara y el umbral de detección antes del análisis de vídeo. Haga clic en Configuración OK para iniciar el análisis y haga clic en Exportar cuando haya terminado.
Lave el sistema con un mililitro de PBS filtrado de 0,2 micrómetros entre cada fracción. Si realiza análisis de microscopía electrónica, utilice un filtro centrífugo de 50 kilodalton para concentrar las fracciones de cromatografía de exclusión de tamaño de interés. Para la extracción de proteínas, mezcle 50 microlitros de tampón RIPA con la muestra EV durante cinco minutos sobre hielo.
Sonicar las muestras tres veces a 500 vatios y 20 kilohercios durante cinco segundos. A continuación, retire los escombros vesiculares centrifugando a 20.000 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Después de aislar las proteínas, realizar la migración de proteínas en el gel de apilamiento de un 12%gel poliacrílico.
Mezclar las proteínas en el gel con Coomassie Blue durante 20 minutos a temperatura ambiente. A continuación, excósten cada pieza de gel de color y la cortan en trozos pequeños. Ponga las piezas de gel a través de una serie de lavados sucesivos como se describe en el manuscrito.
A continuación, séquelos completamente con un concentrador de vacío. Después del secado realizar la reducción de proteínas con 100 microlitros de 100 bicarbonato de amonio mili evolucionado que contiene 10 ditiotrotiol mili evolucionado durante una hora a 56 grados centígrados. A continuación, realice la alquilación proteica con 100 microlitros de bicarbonato de amonio mililar de 100 mililitros que contienen 50 yodoacetamida milimétrica durante 45 minutos en la oscuridad.
Lave las piezas de gel de acuerdo con las instrucciones del manuscrito y séquelas completamente en el concentrador de vacío. Realizar la digestión de proteínas con 50 microlitros de tripsina en 20 bicarbonato de amonio mili evolucionadolar a 37 grados Celsius durante la noche. Al día siguiente, extrae las proteínas digeridas del gel con 50 microlitros de 100%ACN durante 30 minutos a 37 grados centígrados y luego 15 minutos a temperatura ambiente con agitación continua.
A continuación, extraiga las proteínas dos veces con 50 microlitros de 5%TFA en bicarbonato de amonio mililar de 20 mililitros, mientras remueve continuamente durante 20 minutos. Agregue 100 microlitros de ACN y continúe revolviendo durante 10 minutos. Después, secar las proteínas y resuspenderlas en 20 microlitros de 0,1%TFA.
Desalar la muestra utilizando una punta de pipeta de 10 microlitros con medios de fase inversa C 18 para desalar y concentrar péptidos. Luego elúrquelos con ACN y 0,1% de ácido fórmico. Seque completamente la muestra con un concentrador de vacío y la resuspendió en 20 microlitros de ACN y 0,1% de ácido fórmico para espectrometría de masas en tándem de cromatografía líquida, o LC-MS.
Cargue los péptidos digeridos en el instrumento y realice un análisis de muestra. Para confirmar el aislamiento EV, cada fracción SCC fue sometida a un análisis de seguimiento de nanopartículas. El número de partículas fue significativamente mayor en las fracciones cinco, seis y siete.
Estas fracciones se agruparon en una muestra de 2F-EV positivo, y se compararon con fracciones negativas EV, 1F-EV negativo y 3F-EV negativo, utilizando el análisis de manchas occidentales. Los resultados mostraron la presencia de proteína de choque térmico 90 en la muestra positiva EV y en el control de izado celular. La microscopía electrónica de la muestra positiva EV mostró vehículos eléctricos en un rango de tamaño de alrededor de 100 nanómetros y 400 nanómetros.
Se realizó un análisis proteómico con el fin de identificar proteínas contaminantes en muestras negativas EV y caracterizar el contenido proteico de los vehículos eléctricos. Las proteínas identificadas se compararon entre muestras negativas 1F-EV y 2F-EV positivas, así como entre muestras positivas 2F-EV y 3F-EV negativas. Utilizando este método no dirigido, un conjunto de 536 proteínas fueron enviadas a la base de datos ExoCarta y condujeron a la identificación de 86 proteínas asociadas a EV.
Además, esta piscina también permitió la identificación de interacciones proteicas y sus funciones biológicas asociadas. Se encontró que las proteínas de la muestra positiva EV jugaron papeles en las vías inmunes y neuroprotectoras. Los efectos de los vehículos eléctricos derivados de la microglia se evaluaron en el crecimiento de la neurita con células de PC 12 y neuronas primarias de rata.
Se observó un aumento significativo del crecimiento en los vehículos eléctricos en comparación con el control. Los vehículos eléctricos derivados de macrófagos fueron evaluados en la invasión celular del glioma. Se encontró que los vehículos eléctricos deterioraron el crecimiento y la invasión de los esferoides del glioma.
Lo más importante a recordar es desechar con mucho cuidado el sobrenadante del paso de ultracentrifugación para evitar la pérdida de vehículos eléctricos en este procedimiento. Estamos a favor de un enfoque a gran escala y no dirigido para centrarnos en todo el contenido de proteínas y luego en el efecto vertical de los vehículos eléctricos. por lo que el contenido de ácidos nucleicos se puede asociar mediante el análisis.
Con este enfoque de una cultura primaria, somos capaces de discriminar entre proteínas EV y proteínas libres que están fuera de la variedad. Así que la pregunta sigue siendo si esta coagulación es artefacto o más bien algún otro real
