Estos protocolos proporcionan una forma eficaz de estudiar la actividad antitumoral de los ataques de inmunomoduladores. Además, el análisis de las posibilidades asociadas en las citoquinas circulantes y las poblaciones de células inmunitarias se puede realizar utilizando estos métodos propuestos. La principal ventaja de este protocolo es que es una forma fácil y directa de implantar un tumor y controlar su crecimiento. La implicación directa de esta técnica es evaluar la eficacia de ciertas terapias o desafíos en la investigación contra el cáncer. Además, algunos aspectos de estas técnicas son adecuados para estudios de toxicidad. Para comenzar, descongele un vial congelado de células murinas de EERL en un baño de agua precalentado a 37 grados Celsius y transfiéralos a un tubo cónico de 15 mililitros que contenga medios de cultivo calientes. Centrifugar el tubo cónico a 277 veces G durante cinco minutos a 25 grados centígrados para eliminar el medio. A continuación, vuelva a suspender el paladar celular en medios frescos de tres a cinco mililitros y transfiérelo a un matraz de cultivo celular T25. Deje que las células crezcan en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono, expanda a matraces más grandes y pase cada tres días. Cuando haya suficientes células para la implantación deseada en todos los ratones, retire los frascos, deseche el medio y enjuague suavemente las células PBS. A continuación, añade cuatro mililitros de EDTA al 0,25% de tripsina e incuba a 37 grados centígrados durante dos minutos. Agregue medios nuevos para detener la reacción de tripsina y recoja la suspensión celular en tubos cónicos de 50 mililitros. Vuelva a suspender las células en medios nuevos y cuente las células. Centrifugar una vez más, luego agregar PBS frío a las células para obtener una concentración final de 10 millones de células por mililitro. Mantenga la suspensión celular en hielo antes de la inyección. Desinfecte el área del flanco con una almohadilla de etanol. Para inyectar suspensión celular en ratones, aspire 100 microlitros de suspensión celular en la jeringa y elimine todas las burbujas y el espacio muerto de la parte superior. A continuación, inyecte la suspensión celular por vía subcutánea de forma lenta y constante en ratones anestesiados. Coloque a los animales en sus respectivas jaulas y vigílelos hasta que se recuperen de la anestesia. Para recolectar sangre, agarre la piel suelta por encima del hombro con la mano no dominante y perfore la vena submandibular con una aguja o lanceta de calibre 18. Recoja de 200 a 300 microlitros de sangre en un tubo de microcentrífuga de polipropileno de 1,5 mililitros o en un tubo separador de suero. Después de la extracción de sangre, aplique una presión suave en el sitio de punción hasta que el sangrado se haya detenido. Regrese a los ratones a sus respectivas jaulas y observe hasta que se recuperen de la anestesia. Deje que la sangre recolectada se coagule a temperatura ambiente durante 20 a 30 minutos. Luego coloque los tubos en hielo hasta que estén listos para ser centrifugados. Centrifugar la sangre coagulada a 1.540 veces G durante 15 minutos a cuatro grados centígrados y recoger con cuidado la capa de suero de la parte superior. Descongele las muestras de suero o plasma mientras las mantiene en hielo. A continuación, centrifugar las muestras a 1.540 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados, para sedimentar cualquier residuo celular y recoger cuidadosamente la capa de suero de la parte superior. Coloque el kit multiplex a temperatura ambiente y realice el ensayo de acuerdo con el protocolo del fabricante. Coloque cada ratón boca arriba y rocíe etanol al 70% sobre la piel del área abdominal. Use fórceps y tijeras para cortar el ganglio linfático del lado derecho de los ratones y el tumor del lado izquierdo. Si el tumor es grande, córtelo en trozos pequeños y extraiga entre 500 y 600 miligramos del tejido. Coloque los tejidos en los respectivos tubos disociadores que contengan de tres a cinco mililitros de medios RPMI. Homogeneizar el tejido mediante un disociador automatizado. Después de la homogeneización, filtre la suspensión celular a través de un filtro de 70 micrómetros en un tubo cónico de 50 mililitros. Centrifugar a 277 veces G durante cinco minutos a 25 grados centígrados para eliminar el medio. Lave y vuelva a suspender las células en uno o dos mililitros de PBS frío. Utilice una tinción con azul de tripsina al 0,4 % para contar las células viables en un hemocitómetro.Calcule el volumen necesario para obtener de dos a tres millones de celdas y transfiéralas al tubo de fax respectivo. La centrífuga contó las células a 277 veces G durante cinco minutos a 25 grados Celsius.Decantar el sobrenadante y volver a suspender las células en 300 microlitros de PBS. Añade de 0,5 a un microlitro de tinte zombi por tubo e incuba a temperatura ambiente durante 20 minutos en la oscuridad. Centrifugar las células: Lávelas con uno o dos mililitros de tampón de fax y vuelva a suspenderlas en 200 microlitros de tampón de fax. Agregue el bloqueador del receptor FC de acuerdo con el protocolo del fabricante e incube las células durante 10 minutos. Vuelva a centrifugar en los ajustes descritos anteriormente y lave las celdas con uno o dos mililitros de tampón de fax. Agregue el cóctel de anticuerpos e incube durante 30 minutos a cuatro grados centígrados en la oscuridad. Después de la incubación, centrifugar y lavar las células con un tampón de fax de uno a dos mililitros. Agregue de 300 a 400 microlitros de solución de paraformaldehído al 2% y vuelva a suspender para su fijación. Almacene las celdas durante un par de días a cuatro grados centígrados o analícelas inmediatamente con un citómetro de flujo multicolor. En este estudio, se evaluó la actividad antitumoral del polianhídrido IL-1
