Los autores desean agradecer al Programa de Biología de la Universidad de California Davis ratón para la cría de los ratones. Esta investigación fue apoyada por una donación de Merck KGaA, Darmstadt, Alemania.

Todos los estudios con animales y los experimentos se llevaron a cabo bajo un protocolo aprobado por la Universidad de California, Davis Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comité Consultivo administrativa. 1. MUC1.Tg ratón obtención y la reproducción <ol><li> El Programa de Biología del Ratón Davis UC (MBP) razas de tipo salvaje C57BL / 6 ratones machos con heterocigotos MUC1.Tg C57BL / 6 ratones hembra para establecer nuestra colonia. MUC1.Tg crías se entregan los estudios según sea necesario. </li><li> Personal de MBP clip de los dedos de la descendencia en un patrón definido (0-99) para la identificación del ratón y, cuando proceda, el clip de la cola. El dedo o el tejido de la cola se procesan para el genotipado mediante la extracción de ADN estándar y Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), análisis. </li></ol> 2. Diseño del estudio <ol><li> Estudio actividades en grupo <ol><li> Pesar cada ratón por separado en una balanza y se registra el peso en gramos para cada ratón. </li><li> Esta parte del procedimiento de invOlves la metodología y el diseño del estudio. Para la primera parte del estudio, asignar emparejados por edad ratones de tipo salvaje y MUC1.Tg para iniciar la inducción de cáncer de vejiga con OH-BBN. La eutanasia a los ratones 8 semanas después de la última dosis OH-BBN para confirmar la presencia de tumores en la vejiga por la histología. </li><li> Para la segunda parte del estudio, los ratones aleatoriamente MUC1.Tg macho en el número apropiado de grupos de tratamiento y control. Estos ratones serán monitorizados para citoquinas en suero y respuestas inmunes de células T durante la inducción y el desarrollo del tumor, y luego a la terminación del estudio de 8 semanas después de la última dosis OH-BBN. </li></ol></li><li> Inducción de cáncer de vejiga <ol><li> OH-BBN es un agente cancerígeno y altamente tóxico. Por favor, lea y siga las instrucciones de la ficha de datos de seguridad de materiales para la manipulación y almacenamiento de este producto químico. </li><li> Calcular la concentración de la solución de dosificación necesaria para administrar la dosis apropiada (3 mg), en un volumen de 100 l, a cada ratón en base a los pesos medios y Number de los ratones en cada estudio y de grupo. </li><li> Diluir el OH-BBN en etanol 100%. Llevar la concentración final de 30 mg / ml con agua estéril. El final de etanol: concentración de agua debe ser 20:80, v / v </li><li> Administrar el OH-BBN por vía oral usando el acero inoxidable, 20 G agujas por sonda diariamente, 5 días / semana durante 12 semanas, con base en el grupo de asignación de tratamiento a partir de la edad de 8 semanas. </li></ol></li><li> Tratamientos de vacunación <ol><li> Reconstituir cada vial de vacuna de péptido liofilizado en 600 l de 0,9% de solución salina estéril y resuspender a fondo por el dibujo de la solución a través de un 0,5 pulgadas aguja G 27 6x. Uso de solución salina, ajustar la concentración de manera que la dosis deseada se administra en un volumen de 100 l. </li><li> Comenzando en la semana 20, después de la última dosis de OH-BBN, administrar la vacuna en una base semanal de un ciclo de ocho semanas mediante inyección subcutánea de 100 l usando una aguja de calibre 25 (número de semanas se corresponde con la edad de los ratones). </li></ol></li><li> Monitoreo y Toma de Muestras <ol><li> Pesar todos los ratones y palpar la presencia de nuevos tumores una vez cada semana. La eutanasia a los ratones que han perdido ≥ 20% del peso corporal o si hay tumores palpables, sangre en la orina, y / o retención urinaria. </li><li> Antes de la primera dosis OH-BBN y luego a intervalos de 4 semanas a partir de entonces, recoger la sangre entera a través de las hemorragias submandibulares. Recoger la sangre en tubos de coagulación de suero Microtainer (BD), y 30 min para permitir que la sangre se coagule. </li><li> Centrifugar las muestras de sangre en una microcentrífuga a 3500 xg durante 10 min. Transferir cuidadosamente el suero para atornillar criotubos tapa utilizando una pipeta. </li><li> Flash congelación en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C hasta su posterior análisis multiplex. </li><li> Ocho semanas después de la última dosis de OH-BBN, la eutanasia a los ratones por asfixia de CO 2. </li><li> Coloque cada ratón en una tabla de disección y precisar por las cuatro extremidades. </li><li> El uso de pinzas y tijeras, make una incisión horizontal en la región abdominal superior. Insertar las tijeras en la incisión entre la capa de la epidermis y de la pared abdominal y separar suavemente la piel del tejido subyacente con la ayuda de fórceps. </li><li> Hacer una incisión vertical desde la incisión horizontal siguiendo el eje central hacia el extremo anterior del ratón. Separar la piel de la caja torácica, y el uso de una jeringa de 1 ml y una aguja de 22 G, perforar el corazón y recoger la sangre con un empate suave y constante. </li><li> Consulte el paso 2.4.3 y 2.4.4 para el aislamiento y almacenamiento de suero. </li><li> El uso de pinzas y tijeras, cortar y pelar el resto de la capa epidérmica. Corte a través de la pared abdominal y peritoneo y asépticamente extraer el tumor de vejiga de inmunohistoquímica (IHC) y Western blot. </li><li> Recoger el bazo para el análisis de la viabilidad celular (Musa) y ELISPOT. Para IHC, lugar vesical tumoral en casete de tejido y fijar en formalina durante la noche refrigerada a temperatura ambiente. </li&gt; <li> El día siguiente, reemplazar la formalina con etanol al 70%. </li><li> Para el análisis de transferencia de Western de tumor, homogeneizar el tumor, añadir tampón de extracción de proteínas más inhibidores de la proteasa detener y transferir a tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Vortex durante 30-60 segundos y mantener en hielo durante 5 min. Flash congela en nitrógeno líquido y descongelación en agua a temperatura ambiente. Repita el proceso de agitación, la congelación y descongelación dos veces. </li><li> Centrifugar las muestras a 10.000 xg durante 10 min a 4 ° C y transferir los extractos celulares a nuevos tubos etiquetados. </li><li> Cuantificar la concentración mediante la realización de un ensayo de proteína del ácido bicinconínico (BCA) para mediciones de la proteína. Almacene las muestras a -80 ° C hasta el momento de Western blot. </li></ol></li></ol> 3. Biología Molecular / Western Los siguientes procedimientos se llevaron a cabo para verificar la expresión de MUC1 en la vejiga del ratón tejido tumoral utilizando el protocolo de transferencia Western estándar (datos no muestrann). <ol><li> Separar los extractos de proteínas por electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) y luego se transfieren a una membrana de PVDF utilizando un aparato semiseco. </li><li> Bloquear la membrana de la proteína transferida con 5% de leche sin grasa en 0,1% de Tween-20 en tampón fosfato salino (PBS-T) de pH 7,4 durante 1 hora en un agitador orbital a temperatura ambiente. </li><li> Se incuba la membrana durante 1 hora a temperatura ambiente en un agitador con anticuerpo anti-MUC1 o anti-β-actina en 0,1% de PBS-T. </li><li> Lavar la membrana por decantación la solución y la adición de 0,1% de PBS-T. Remolino de la membrana en el agitador durante 5 minutos y se decanta. Repita este paso dos veces. </li><li> Se incuba la membrana durante 1 hora a temperatura ambiente con una peroxidasa de rábano picante (HRP) conjugada con anticuerpo secundario. </li><li> Lave 3 veces (consulte el paso 3.4). </li><li> Siga el protocolo para el kit de quimioluminiscencia mejorada (ECL) para activar y leer el fluorografía. </li></ol> 4. Multiplex Fluorometric Inmunoensayo microcuentas &lt;ol&gt; <li> Configuración y Cálculos <ol><li> Usar un mapa placa de 96 pocillos, ceder espacios en blanco, estándares, controles y muestras problema a los pocillos. Calcular el número y el volumen de analitos, la captura de anticuerpos y estreptavidina-ficoeritrina (SA-PE) necesario para el ensayo. </li><li> Permitir que todos los tampones y diluyentes alcancen la temperatura ambiente. Preparar los estándares y las diluciones de muestra usando una placa de 96 pocillos en blanco. </li><li> Reconstituir la matriz de suero y estándar liofilizada de acuerdo con el protocolo del fabricante y hacer diluciones seriadas 1:05 de la norma con el diluyente apropiado en la placa de 96 pocillos. Para los pocillos de blanco, utilizar el diluyente apropiado. </li><li> Diluir todos los controles y muestras desconocidas 1:02 en el diluyente apropiado en el resto de la placa de 96 pocillos. </li><li> Para la mezcla de microesferas, pipetear el volumen requerido de diluyente apropiado en un tubo de 15 ml. Vortex cada vial de microesferas durante 20 seg y la pipeta el volumen requerido de cada analito en el tubo de 15 ml. </li&gt; <li> Proteja siempre las cuentas de la luz para evitar photobleaching. No coloque la placa de 96 pocillos con material absorbente para evitar la pérdida de la muestra por capilaridad. </li></ol></li><li> Protocolo de ensayo <ol><li> Prehumedecido la placa de 96 pocillos de fondo filtro con 200 l de tampón de ensayo y permitir la impregnación completa del filtro. Drenar suavemente utilizando el aparato de vacío placa de 96 pocillos y secar la parte inferior de la placa con una toalla de papel. </li><li> Con una pipeta multicanal, pipetas 25 l de matriz de suero en los pocillos asignados a los blancos y patrones y pipeta de 25 l de tampón de ensayo a los pocillos asignados a los controles y las incógnitas. </li><li> Pipetear 25 l de la pieza en bruto, las normas, controles y desconocidos a los respectivos pozos asignados. Agite la mezcla de microesferas durante 20 segundos y transferir las cuentas a un depósito. </li><li> Pipetear 25 l de la mezcla de microesferas en cada pocillo. Cubrir la placa con papel de aluminio o una placa de tapa opaca para protegerlo de la luz. </li><li&gt; Agitar la placa a 500 rpm durante dos horas a temperatura ambiente en un agitador de placas. Escurrir y lavar la placa con 200 l de 0,1% de Tween 20 en tampón fosfato salino (PBS-T) dos veces. Escurrir y secar. </li><li> Prepare la solución de anticuerpo de captura. Pipetear la cantidad requerida de 0,1% de PBS-T y anticuerpo de captura en un tubo de 15 ml y agitar durante 10 seg. Transferir la mezcla de anticuerpo de captura a un depósito y la pipeta 25 l en cada pocillo. </li><li> Agitar la placa a 500 rpm durante una hora a temperatura ambiente en un agitador de placas. Escurrir y lavar la placa con 200 l de 0,1% PBS-T dos veces. Escurrir y secar. </li><li> Prepare la solución de SA-PE. Pipetear el volumen requerido de 0,1% de PBS-T y SA-PE en un tubo de 15 ml y agitar durante 10 seg. Transferir la solución a un depósito y la pipeta 25 l en cada pocillo. </li><li> Agitar la placa a 500 rpm durante 30 min a temperatura ambiente en un agitador de placas. Escurrir y lavar la placa con 200 l de 0,1% PBS-T dos veces. Escurrir y bmuchos seco. </li><li> Pipetear 100 l de 0,1% de PBS-T y agitar en un agitador de placas a 500 rpm durante al menos dos minutos para resuspender las perlas. Leer y analizar la placa en la máquina LX200 Luminex. </li></ol></li></ol> 5. IFN-γ/IL-4 ELISpot Preparación y Análisis <ol><li> En una cabina de seguridad biológica, procesar los bazos a través de tejido de nylon 100 micras tamices en 5 ml de solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS) en placas de Petri estériles. Capa de los esplenocitos en 3 ml de medio de separación de linfocitos en tubos estériles de 15 ml. </li><li> Centrifugar los tubos a 600 xg durante 15 minutos para separar los linfocitos de las células rojas de la sangre. La transferencia de los linfocitos en capas por encima de la pendiente de nuevos tubos estériles de 15 ml. </li><li> Ajuste el volumen a 10 ml con PBS estéril. Centrifugar la suspensión a 600 xg durante 10 min para sedimentar las células. </li><li> Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 1 ml de PBS para la viabilidad celular y contar con la Musaanalizador. Siga el conde Muse y protocolo Kit Viabilidad. </li><li> Hacer diluciones seriadas de los linfocitos en 1,5 ml de tubos con cierre de tornillo centrifugar a factores de dilución de 1:10, 1:20 y 1:40 (o si necesario) de Count &amp; Reactivo Viabilidad (mínimo volumen total 300 l). Pipetear cada dilución arriba y abajo varias veces para mezclar y analizar en el Muse. </li><li> Elaborar un mapa de la placa de las muestras y las condiciones para la placa ELISpot. Preparar la placa de ELISPOT de acuerdo con el protocolo del fabricante y pipeta de 100 l de medio, el péptido (10 g / ml), o péptido (10 g / ml) a cada pocillo lucha. </li><li> Pipetear 100 l de suspensión celular, la entrega de 1,0 x 10 6 células a cada pocillo e incubar la placa a 37 ° C durante la noche. </li><li> Seguir el protocolo del fabricante para el ensayo ELISPOT. Analizar la placa ELISpot desarrollada usando un microscopio de disección. </li><li> Cuantificar los resultados mediante el recuento del número de manchas de color corresponding a cada analito en cada pocillo. Los puntos corresponden al número de células formadoras de punto (SFC) en cada pocillo. </li></ol> 6. La inmunohistoquímica (IHC) y hematoxilina y eosina (H &amp; E) tinción <ol><li> Tome el tejido tumoral de vejiga conservada como se describió anteriormente (sección 2.4.11), insertar en parafina y la sección paso a los 4 m para el análisis inmunohistoquímico. </li><li> Realizar IHC usando un anticuerpo MUC1 que reconoce la región de repetición en tándem de MUC1. Utilice el kit de peroxidasa de Investigación de Animales para minimizar la reactividad del anticuerpo secundario del ratón con inmunoglobulina endógena presente en el tejido. </li><li> Realizar H &amp; E tinción utilizando protocolos estándar. </li></ol> 7. Métodos Estadísticos Para el Multiplex Fluorometric Inmunoensayo microcuentas, utilice la prueba t de Student de dos colas para comparar el promedio observado concentraciones de citoquinas en suero entre los grupos de tratamiento y control. Para ELISpot, utilice una sola way ANOVA para comparar el punto de formación de colonias entre el control de los medios de comunicación, revueltos péptido y grupos de péptidos. Utilice prueba de comparación múltiple de Dunnett para disminuir la probabilidad de un resultado positivo falso. Un valor de p ≤ 0,05 se consideraron significativamente diferentes para todos los análisis.

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Med. 42 (5), 726-732 (2001).</li><li>Hughes, O., Bishop, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+superficial+bladder+cancer+by+the+intravesical+administration+of+67copper-labelled+anti-MUC1+mucin+monoclonal+antibody+C595.">Targeting superficial bladder cancer by the intravesical administration of 67copper-labelled anti-MUC1 mucin monoclonal antibody C595.</a> J. Clin. Oncol. 18 (2), 363-370 (2000).</li><li>Conn, I. G., Crocker, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HMFG-2+as+a+prognostic+indicator+in+superficial+bladder+cancer.">HMFG-2 as a prognostic indicator in superficial bladder cancer.</a> J. Clin. Pathol. 41 (11), 1191-1195 (1988).</li><li>Hughes, O., Denley, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MUC1+mucin+expression+in+transitional+cell+carcinoma+of+the+bladder:+a+target+for+diagnosis+and+therapy+with+monoclonal+antibody+C595.">MUC1 mucin expression in transitional cell carcinoma of the bladder: a target for diagnosis and therapy with monoclonal antibody C595.</a> J. Urol. Pathol. 12, 185-197 (2000).</li><li>Rowse, G. J., Tempero, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerance+and+immunity+to+MUC1+in+a+human+MUC1+transgenic+murine+model.">Tolerance and immunity to MUC1 in a human MUC1 transgenic murine model.</a> Cancer Res. 58 (2), 315-321 (1998).</li><li>Mukherjee, P., Madsen, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucin-1+specific+immunotherapy+in+a+mouse+model+of+spontaneous+breast+cancer.">Mucin-1 specific immunotherapy in a mouse model of spontaneous breast cancer.</a> J. Immunother. 26 (1), 47-62 (2003).</li><li>McCormick, D. L., Ronan, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+total+dose+and+dose+schedule+on+induction+of+urinary+bladder+cancer+in+the+mouse+by+N-butyl-N-(4-hydroxy-butyl)nitrosamine.">Influence of total dose and dose schedule on induction of urinary bladder cancer in the mouse by N-butyl-N-(4-hydroxy-butyl)nitrosamine.</a> Carcinogenesis. 2 (3), 251-254 (1981).</li><li>Wurz, G. T., Gutierrez, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antitumor+effects+of+L-BLP25+antigen-specific+tumor+immunotherapy+in+a+novel+human+MUC1+transgenic+lung+cancer+mouse+model.">Antitumor effects of L-BLP25 antigen-specific tumor immunotherapy in a novel human MUC1 transgenic lung cancer mouse model.</a> J. Transl. Med. 11, 10-1186 (2013).</li><li>Kunze, E., Schauer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+transformation+in+the+development+of+N-butyl-N-(4hydroxybutyl)-nitrosamine-induced+transitional+cell+carcinomas+in+the+urinary+bladder+of+rats.">Stages of transformation in the development of N-butyl-N-(4hydroxybutyl)-nitrosamine-induced transitional cell carcinomas in the urinary bladder of rats.</a> Z Krebsforsch Klin. Onkol. Cancer Res. Clin. Oncol. 87 (2), 139-160 (1976).</li><li>Crallan, R. A., Georgopoulos, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+models+of+human+bladder+carcinogenesis.">Experimental models of human bladder carcinogenesis.</a> Carcinogenesis. 27 (3), 374-381 (2006).</li><li>Samma, S., Uemura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+induction+of+carcinoma+in+situ+in+dog+urinary+bladder+by+sequential+treatment+with+N-methyl-N'-nitrosourea+and+N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine.">Rapid induction of carcinoma in situ in dog urinary bladder by sequential treatment with N-methyl-N'-nitrosourea and N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine.</a> Gann. 75 (5), 385-387 (1984).</li><li>Bornhof, C., Wolfrath, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+urinary+bladder+urothelial+cancers+in+the+rabbit+by+dibutylnitrosamine+with+an+artificial+bladder+calculus+as+cocarcinogen.">Induction of urinary bladder urothelial cancers in the rabbit by dibutylnitrosamine with an artificial bladder calculus as cocarcinogen.</a> Urologe A. 28 (6), 339-343 (1989).</li><li>Irving, C. C., Tice, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+N-n-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine-induced+urinary+bladder+cancer+in+rats+by+administration+of+disulfiram+in+the+diet.">Inhibition of N-n-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine-induced urinary bladder cancer in rats by administration of disulfiram in the diet.</a> Cancer Res. 39 (8), 3040-3043 (1979).</li><li>Mehta, N. R., Wurz, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-BLP25+vaccine+plus+letrozole+induces+a+TH1+immune+response+and+has+additive+antitumor+activity+in+MUC1-expresssing+mammary+tumors+in+mice.">L-BLP25 vaccine plus letrozole induces a TH1 immune response and has additive antitumor activity in MUC1-expresssing mammary tumors in mice.</a> Clin. Cancer Res. 18 (10), 2861-2871 (2012).</li></ol>

DPV, MMA, SMG, CJK, AMG y GKH no declarar los intereses en conflicto. MWD es el investigador principal de la subvención recibida de Merck KGaA y MW es un empleado de Merck KGaA.

La inducción exitosa de carcinoma de células transicionales de vejiga y de células escamosas invasivo en ratones MUC1.Tg humanos ofrece un modelo preclínico para el desarrollo de la inmunoterapia. Estudios inmunoterapéuticas requieren el uso de un modelo intacta espontánea, inmunológico con el fin de evaluar la respuesta inflamatoria a la progresión del tumor con el tiempo, así como la respuesta inmune a la inmunoterapia. En un modelo desarrollo de tumores espontáneo, el microambiente tumoral se mantiene intac...

El cáncer de vejiga es el cuarto tipo de cáncer más común y la octava causa de muerte por cáncer en los hombres estadounidenses. En los Estados Unidos, se espera que unos 72.500 nuevos casos y 15.000 muertes por cáncer de vejiga entre los hombres y mujeres en conjunto en 2013 1. La incidencia de cáncer de vejiga es aproximadamente tres veces mayor en los hombres que en las mujeres. En los Estados Unidos, carcinomas de células transicionales (TCC) representan más del 90% de los casos, mientras que los carcinomas de células escamosas (SCC) tienen una incidencia de menos de 2% 2. La tasa de supervivencia a 5 años relativa global para papilar TCC es 91,5% frente a sólo el 30,9% de SCC 2. Aunque los TCC papilares no invasivos representan aproximadamente el 75% de los casos en el momento del diagnóstico, incluso con el tratamiento de más de 50% de los pacientes experimentará una recurrencia dentro de 5 años, con un máximo de 30% de estos pacientes progresa a la enfermedad invasiva del músculo 3,4 . Pautas de tratamiento habituales para inv no músculoenfermedad ASIVE incluye la resección transuretral (TUR) seguida de quimioterapia intravesical. En pacientes con Ta de alto grado o tumores T1, una repetición TUR se puede realizar antes de la quimioterapia 3,4. Para aquellos pacientes con recurrencias Ta de bajo grado o Ta de alto grado o lesiones T1, RTU seguida de quimioterapia o inmunoterapia adyuvante en la forma de bacilo de Calmette-Guerin (BCG) se puede usar 3,4. Intravesical de BCG se ha demostrado ser superior a la mitomicina C intravesical con respecto al tiempo hasta la recurrencia 5. Para la enfermedad invasiva del músculo T2, la cistectomía radical con o sin quimioterapia neoadyuvante es el tratamiento recomendado 3. En los pacientes con SCC, la cistectomía radical parece ser el tratamiento más efectivo 6. Dadas las altas tasas de recurrencia a pesar de los tratamientos disponibles, existe una clara necesidad de nuevas terapias más eficaces para el cáncer de vejiga. Ampliar nuevas inmunoterapias para Bladdcáncer er es un posible enfoque que puede mantener la promesa para prolongar la supervivencia libre de enfermedad. Históricamente, BCG ha sido la única inmunoterapia eficaz para el cáncer de vejiga. Se cree que su mecanismo de acción para involucrar a la inducción no específica de una respuesta inmunitaria de tipo T helper 1 (Th1) a través de aumento de los niveles de interleucina-2 (IL-2) y el interferón gamma (IFN-γ) 4. Celular, o la inmunidad Th1, es crítico en la inmunoterapia del cáncer como humoral, o Th2, inmunidad nunca se ha demostrado ser eficaz contra los tumores sólidos, con la excepción de anticuerpos dirigidos contra los receptores del factor de crecimiento 7. En un intento de mejorar los beneficios de BCG monoterapia, IFN-α combinación 2B/BCG inmunoterapia se evaluó en un ensayo clínico de fase II con resultados no concluyentes 8. Una aproximación alternativa a la inmunoterapia para el cáncer de vejiga puede ser para dirigir antígenos asociados a tumores (TAA), la identificación de lo que ha hecho la inmunoterapia del cáncer más específica 7 </sa&gt;. Uno de estos TAA es mucina 1 (MUC1), que es una glicoproteína de superficie celular sobreexpresados ​​en muchos cánceres de células epiteliales, tales como la vejiga, de mama, de pulmón, y cáncer de páncreas 9,10. La expresión y la modificación de MUC1 también se altera sustancialmente durante la carcinogénesis, de tal manera que underglycosylation expone secuencias antigénicas de aminoácidos conocidos como número variable de repeticiones en tándem (VNTR) en el núcleo peptídico. Mientras MUC1 es una auto-molécula, estas regiones VNTR inmunodominantes no están normalmente expuestos debido a la amplia glicosilación, y por lo tanto son vistos por el sistema inmune como 11,12 extranjera. Los linfocitos T citotóxicos (CTL) que reconocen específicamente epítopos de MUC1 se han aislado de los ganglios linfáticos que drenan el tumor de los pacientes de cáncer de mama 13, así como la sangre y la médula ósea de pacientes con mieloma 14,15, haciendo MUC1 un blanco potencial para un respuesta inmune celular. Los VNTR inmunodominantes de la underglycosylated forma de MUC1 son reconocidos por CTL, lo que resulta en la destrucción de las células tumorales 16-19. La respuesta inmune celular y / o humoral nativos a MUC1 cancerosos son, sin embargo, no lo suficientemente fuerte como para eliminar los tumores. Para aumentar la respuesta inmune débil ya existente para MUC1, péptidos inmunodominantes sintéticos se pueden introducir a través de la vacunación para generar una respuesta de CTL lo suficientemente fuerte para ser de beneficio clínico 18,20. Una vacuna liposomal MUC1 ya se ha demostrado que aumenta la supervivencia en pacientes con cáncer de pulmón 21,22, generar CTL capaces de matar las células tumorales positivas para MUC1, y producir una respuesta de citoquinas Th1-polarizado 23,24. Con un alto nivel de expresión de MUC1 9,11,25, cáncer de vejiga es un candidato lógico para probar MUC1-inmunoterapia dirigida 26,27. Además, MUC1 tiene potencial como factor pronóstico en el cáncer de vejiga 28, MUC1 expresión en TCC se asoció significativamente con el estadio y grado, y metastásicos TCCse ha demostrado que continuar expresando MUC1 29. Con el fin de evaluar la utilidad potencial de la inmunoterapia MUC1-dirigida en el cáncer de vejiga, hemos desarrollado un MUC1 humano intacto inmune (hMUC1)-expresando transgénico (MUC1.Tg) modelo de ratón de congenic cáncer de vejiga en los C57BL / 6 de fondo 30. MUC1 humana se expresa como un auto-proteínas bajo el control de su propio promotor, que resulta en un patrón de expresión de tejido consistente con la observada en los seres humanos 30,31. Los ratones se indujeron con el conocido carcinógeno vejiga N-butil-N-(4-hidroxibutil) nitrosamina (OH-BBN) 32, y a continuación, se evaluaron los tumores resultantes para hMUC1 expresión y el tipo y grado del tumor. Para evaluar el efecto de la sustancia cancerígena en los niveles de citoquinas Th1/Th2 durante el desarrollo de tumores, se recogieron muestras de suero periódicamente para el análisis múltiplex. Los ratones fueron tratados con una vacuna de péptido MUC1-específica, y la citoquina en suero y respuestas inmunes eran evaluaciónted por múltiplex inmunoensayo fluorimétrico microbead y ELISpot.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine (OH-BBN)</td>
			<td>TCI America</td>
			<td>B0938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 G Gavage Needles</td>
			<td>Popper &#38; Sons, Inc.</td>
			<td>7921</td>
			<td>Stainless steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide Vaccine</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>investigational agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Microtainers</td>
			<td>BD</td>
			<td>365957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Cassettes</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M490-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SF100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis Buffer</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>87787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease &#38; Phosphatase inhibitor cocktail</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>78444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Cytokine 20plex Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LMC006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Microsphere Beads</td>
			<td>Luminex</td>
			<td>MC100xx-01</td>
			<td>xx is the bead region</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse TNF- Capture Antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>551225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse TNF- Detection Antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>554415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IFN- Capture Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab10742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IFN- Detection Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab83136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3813-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay Buffer</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>L-MAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokine Standard</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MXM8070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-screen HTS 96well filter plates</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MSBVN1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SA-PE</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>SA10044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 m Nylon Tissue Sieves</td>
			<td>BD</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Splenocyte Separation Media</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-829E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF- /IL-4 ELISpot plates</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>ELD5217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-MUC1 monoclonal antibody</td>
			<td>Epitomics</td>
			<td>2900-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-actin monoclonal antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1978</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit HRP antibody</td>
			<td>Promega</td>
			<td>W401B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse HRP antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td>
			<td>SC-2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>162-0174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Protean TGX Precast Gels</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>456-1083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muse Count &#38; Viability Kit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MCH100104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MUC1 Antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>550486</td>
			<td>IHC antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Research Peroxidase Kit</td>
			<td>Dako</td>
			<td>K3954</td>
			<td>IHC staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment and Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore plate vaccum apparatus</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MSVMHTS00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminex Lx200</td>
			<td>Millipore / Luminex</td>
			<td>40-013</td>
			<td>Manufactured by Luminex, distributed by Millipore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminex Xponent Software</td>
			<td>Millipore / Luminex</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Version 3.1; included with Luminex Lx200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milliple Analyst Software</td>
			<td>Milliplex / VigeneTech</td>
			<td>40-086</td>
			<td>Version 5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muse Cell Analyzer</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>0500-3115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muse Software</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Version 1.1.0.0; included with Analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Unitron</td>
			<td>Z730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism Software</td>
			<td>Graphpad Software Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Version 5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Protean Tetra Cell Gel apparatus</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>165-8001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans Blot SD Cell and PowerPac</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>170-3849</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of invasive transitional cell bladder carcinoma in immune intact human muc1 transgenic mice:  a model for immunotherapy development

Un modelo preclínico de cáncer de vejiga invasivo fue desarrollado en mucina humana 1 (MUC1) transgénicos (MUC1.Tg) ratones para el propósito de la evaluación de la inmunoterapia y / o quimioterapia citotóxica. Para inducir el cáncer de vejiga, C57BL / 6 ratones (tipo MUC1.Tg y silvestres) fueron tratados por vía oral con el carcinógeno N-butil-N-(4-hidroxibutil) nitrosamina (OH-BBN) a 3,0 mg / día, 5 días / semana durante 12 semanas. Para evaluar los efectos de OH-BBN en el perfil de citoquinas en suero durante el desarrollo del tumor, sangre total se recogió a través de hemorragias submandibulares antes del tratamiento y cada cuatro semanas. Además, una vacuna de péptido MUC1-específica y el placebo se administraron a grupos de ratones a la semana durante ocho semanas. Se realizaron Multiplex fluorométricos inmunoanálisis microperlas de citoquinas en suero durante el desarrollo del tumor y después de la vacunación. A la terminación, el interferón gamma (IFN-γ) / interleucina-4 (IL-4) análisis de ELISPOT para MUC1 respuesta inmune de células T específica y evaluaciones histopatológicas de tipo de tumory se realizaron grado. Los resultados mostraron que: (1) la incidencia de cáncer de vejiga en ratones de tipo salvaje tanto MUC1.Tg y fue de 67%; (2) carcinomas de células transicionales (TCC) desarrollados en la relación 2:1 en comparación con carcinomas de células escamosas (SCC) ; (3) las citoquinas inflamatorias se incrementaron con el tiempo durante el desarrollo del tumor, y (4) la administración de la vacuna de péptido induce un perfil de citoquinas Th1-polarizado suero y una respuesta de células T específica MUC1. Todos los tumores en ratones MUC1.Tg fueron positivos para la expresión de MUC1, y la mitad de todos los tumores en ratones de tipo salvaje y MUC1.Tg eran invasiva. En conclusión, el uso de un enfoque de equipo a través de la coordinación de los esfuerzos de los farmacólogos, inmunólogos, anatomopatólogos y biólogos moleculares, hemos desarrollado un modelo de ratón transgénico intacto inmunológico del cáncer de vejiga que expresa hMUC1.

La evaluación preclínica de los efectos de las nuevas inmunoterapias y combinaciones en el cáncer de vejiga requiere el desarrollo de un modelo animal adecuado. En nuestro modelo de ratón transgénico, la inducción con el carcinógeno químico OH-BBN dio lugar a una alta tasa de incidencia del cáncer de vejiga predominantemente de TCC con un poco de SCC, que es similar al cáncer de vejiga en humanos. Para determinar la histología del tumor, el estado MUC1 expresión y la respuesta inmune a la vacuna de péptido ...

Watch this Scientific Journal Video about Induction of Invasive Transitional Cell Bladder Carcinoma in Immune Intact Human MUC1 Transgenic Mice:  A Model for Immunotherapy Development at JoVE.com

Induction of Invasive Transitional Cell Bladder Carcinoma in Immune Intact Human MUC1 Transgenic Mice:  A Model for Immunotherapy Development

Una N-butil-N-(4-hidroxibutil) nitrosamina inducida modelo de cáncer de vejiga fue desarrollado en mucina humana 1 (MUC1) ratones transgénicos para el propósito de las pruebas de MUC1-inmunoterapia dirigida. Después de la administración de una vacuna de péptido MUC1-específica, una respuesta de linfocitos T citotóxicos para MUC1 se confirmó mediante la medición de los niveles séricos de citocinas y la actividad de células T específicas.

La inducción de la transición de vejiga invasivo Carcinoma en inmune intacto humanos MUC1 Ratones Transgénicos: Un Modelo para el Desarrollo Inmunoterapia

A preclinical model of invasive bladder cancer was developed in human mucin 1 (MUC1) transgenic (MUC1.Tg) mice for the purpose of evaluating immunotherapy ...

induction-invasive-transitional-cell-bladder-carcinoma-immune-intact

Research

JoVE Journal

Medicine

21.1K vistas.  University of California, Davis. Una N-butil-N-(4-hidroxibutil) nitrosamina inducida modelo de cáncer de vejiga fue desarrollado en mucina humana 1 (MUC1) ratones transgénicos para el propósito de las pruebas de MUC1-inmunoterapia dirigida. Después de la administración de una vacuna de péptido MUC1-específica, una respuesta de linfocitos T citotóxicos para MUC1 se confirmó mediante la medición de los niveles séricos de citocinas y la actividad de células T específicas.

Video: Induction of Invasive Transitional Cell Bladder Carcinoma in Immune Intact Human MUC1 Transgenic Mice:  A Model for Immunotherapy Development

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited time. These cultured tumorspheres may exhibit markedly different cellular phenotypes when compared to the original tumors. Demonstration that cultured cells have the capability of forming new tumors is important to ensure that cultured cells model the biology of the original tumor. 
Here we present a protocol for propagating human retinoblastoma tumors in vivo using Rag2-/- immune deficient mice. Cultured human retinoblastoma tumorspheres of low passage or cells obtained from freshly harvested human retinoblastoma tumors injected directly into the vitreous cavity of murine eyes form tumors within 2-4 weeks. These tumors can be harvested and either further passaged into murine eyes in vivo or grown as tumorspheres in vitro. Propagation has been successfully carried out for at least three passages thus establishing a continuing source of human retinoblastoma tissue for further experimentation. 
Wesley S. Bond and Lalita Wadhwa are co-first authors.

A method is described to propagate human retinoblastoma tumors in mice. Tumor cells are directly injected into the eyes of immune deficient mice. Secondary tumors have been successfully established using both cells directly harvested from human tumors and cultured tumorspheres.

Establecimiento y propagación de los tumores del retinoblastoma humanos en ratones con deficiencia inmune

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Investigación

Medicina

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-fotón imágenes de invasión de células tumorales en un modelo de ratón ortotópico de carcinoma oral de células escamosas

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Protocol for Long Duration Whole Body Hyperthermia in Mice

Hyperthermia is a general term used to define the increase in core body temperature above normal. It is often used to describe the increased core body temperature that is observed during fever. The use of hyperthermia as an adjuvant has emerged as a promising procedure for tumor regression in the field of cancer biology. For this purpose, the most important requirement is to have reliable and uniform heating protocols. We have developed a protocol for hyperthermia (whole body) in mice. In this protocol, animals are exposed to cycles of hyperthermia for 90 min followed by a rest period of 15 min. During this period mice have easy access to food and water. High body temperature spikes in the mice during first few hyperthermia exposure cycles are prevented by immobilizing the animal. Additionally, normal saline is administered in first few cycles to minimize the effects of dehydration. This protocol can simulate fever like conditions in mice up to 12-24 hr. We have used 8-12 weeks old BALB/Cj female mice to demonstrate the protocol.

This paper describes a protocol for whole body hyperthermia in mice that can stimulate fever like conditions up to 12-24 hr.

Protocolo para la hipertermia corporal Larga Duración Total en ratones

Hyperthermia is a general term used to define the increase in core body temperature above normal. It is often used to describe the increased core body ...

The Use of Cystometry in Small Rodents: A Study of Bladder Chemosensation

The lower urinary tract (LUT) functions as a dynamic reservoir that is able to store urine and to efficiently expel it at a convenient time. While storing urine, however, the bladder is exposed for prolonged periods to waste products. By acting as a tight barrier, the epithelial lining of the LUT, the urothelium, avoids re-absorption of harmful substances. Moreover, noxious chemicals stimulate the bladder's nociceptive innervation and initiate voiding contractions that expel the bladder's contents. Interestingly, the bladder's sensitivity to noxious chemicals has been used successfully in clinical practice, by intravesically infusing the TRPV1 agonist capsaicin to treat neurogenic bladder overactivity1. This underscores the advantage of viewing the bladder as a chemosensory organ and prompts for further clinical research. However, ethical issues severely limit the possibilities to perform, in human subjects, the invasive measurements that are necessary to unravel the molecular bases of LUT clinical pharmacology. A way to overcome this limitation is the use of several animal models2. Here we describe the implementation of cystometry in mice and rats, a technique that allows measuring the intravesical pressure in conditions of controlled bladder perfusion.
	After laparotomy, a catheter is implanted in the bladder dome and tunneled subcutaneously to the interscapular region. Then the bladder can be filled at a controlled rate, while the urethra is left free for micturition. During the repetitive cycles of filling and voiding, intravesical pressure can be measured via the implanted catheter. As such, the pressure changes can be quantified and analyzed. Moreover, simultaneous measurement of the voided volume allows distinguishing voiding contractions from non-voiding contractions3.
	Importantly, due to the differences in micturition control between rodents and humans, cystometric measurements in these animals have only limited translational value4. Nevertheless, they are quite instrumental in the study of bladder pathophysiology and pharmacology in experimental pre-clinical settings. Recent research using this technique has revealed the key role of novel molecular players in the mechano- and chemo-sensory properties of the bladder.

Cystometry is an efficient technique to measure bladder function of small animals in vivo. The bladder is continuously infused at rates controlled through an intravesical catheter, whereas the urethra is left free for micturition. This allows for repetitive filling and emptying of the bladder, while intravesical pressure and voided volume are recorded.

El uso de la cistometría en pequeños roedores: un estudio de la vejiga chemosensation

	The lower urinary tract (LUT) functions as a  dynamic reservoir that is able to store urine and to efficiently expel it at a  convenient time. While ...

Generation of Subcutaneous and Intrahepatic Human Hepatocellular Carcinoma Xenografts in Immunodeficient Mice

In vivo experimental models of hepatocellular carcinoma (HCC) that recapitulate the human disease provide a valuable platform for research into disease pathophysiology and for the preclinical evaluation of novel therapies. We present a variety of methods to generate subcutaneous or orthotopic human HCC xenografts in immunodeficient mice that could be utilized in a variety of research applications. With a focus on the use of primary tumor tissue from patients undergoing surgical resection as a starting point, we describe the preparation of cell suspensions or tumor fragments for xenografting. We describe specific techniques to xenograft these tissues i) subcutaneously; or ii) intrahepatically, either by direct implantation of tumor cells or fragments into the liver, or indirectly by injection of cells into the mouse spleen. We also describe the use of partial resection of the native mouse liver at the time of xenografting as a strategy to induce a state of active liver regeneration in the recipient mouse that may facilitate the intrahepatic engraftment of primary human tumor cells. The expected results of these techniques are illustrated. The protocols described have been validated using primary human HCC samples and xenografts, which typically perform less robustly than the well-established human HCC cell lines that are widely used and frequently cited in the literature. In comparison with cell lines, we discuss factors which may contribute to the relatively low chance of primary HCC engraftment in xenotransplantation models and comment on technical issues that may influence the kinetics of xenograft growth. We also suggest methods that should be applied to ensure that xenografts obtained accurately resemble parent HCC tissues.

Human tumor xenografts in immunodeficient mice are valuable tools to study cancer biology. Specific protocols to generate subcutaneous and intrahepatic xenografts from human hepatocellular carcinoma cells or tumor fragments are described. Liver regeneration induced by partial hepatectomy in recipient mice is presented as a strategy to facilitate intrahepatic engraftment.

Generación de subcutánea e intrahepática hepatocelular carcinoma humano xenoinjertos en ratones inmunodeficientes

In  vivo experimental models of hepatocellular carcinoma (HCC) that recapitulate  the human disease provide a valuable platform for research into disease  ...

Urinary Bladder Distention Evoked Visceromotor Responses as a Model for Bladder Pain in Mice

Approximately 3-8 million people in the United States suffer from interstitial cystitis/bladder pain syndrome (IC/BPS), a debilitating condition characterized by increased urgency and frequency of urination, as well as nocturia and general pelvic pain, especially upon bladder filling or voiding. Despite years of research, the cause of IC/BPS remains elusive and treatment strategies are unable to provide complete relief to patients. In order to study nervous system contributions to the condition, many animal models have been developed to mimic the pain and symptoms associated with IC/BPS. One such murine model is urinary bladder distension (UBD). In this model, compressed air of a specific pressure is delivered to the bladder of a lightly anesthetized animal over a set period of time. Throughout the procedure, wires in the superior oblique abdominal muscles record electrical activity from the muscle. This activity is known as the visceromotor response (VMR) and is a reliable and reproducible measure of nociception. Here, we describe the steps necessary to perform this technique in mice including surgical manipulations, physiological recording, and data analysis. With the use of this model, the coordination between primary sensory neurons, spinal cord secondary afferents, and higher central nervous system areas involved in bladder pain can be unraveled. This basic science knowledge can then be clinically translated to treat patients suffering from IC/BPS.

Approximately 3-8 million people in the United States suffer from interstitial cystitis/bladder pain syndrome (IC/BPS), a debilitating condition characterized in part by pelvic pain. In order to study nervous system contributions to the condition, a physiological model of urinary bladder pain is used in mice and rats.

Las respuestas de la Vejiga Urinaria Distensión Evocados visceromotor como modelo para la vejiga Dolor en ratones

Approximately 3-8 million people in the United States suffer from interstitial cystitis/bladder pain syndrome (IC/BPS), a debilitating condition ...

Facial Nerve Axotomy in Mice: A Model to Study Motoneuron Response to Injury

The goal of this surgical protocol is to expose the facial nerve, which innervates the facial musculature, at its exit from the stylomastoid foramen and either cut or crush it to induce peripheral nerve injury. Advantages of this surgery are its simplicity, high reproducibility, and the lack of effect on vital functions or mobility from the subsequent facial paralysis, thus resulting in a relatively mild surgical outcome compared to other nerve injury models. A major advantage of using a cranial nerve injury model is that the motoneurons reside in a relatively homogenous population in the facial motor nucleus in the pons, simplifying the study of the motoneuron cell bodies. Because of the symmetrical nature of facial nerve innervation and the lack of crosstalk between the facial motor nuclei, the operation can be performed unilaterally with the unaxotomized side serving as a paired internal control. A variety of analyses can be performed postoperatively to assess the physiologic response, details of which are beyond the scope of this article. For example, recovery of muscle function can serve as a behavioral marker for reinnervation, or the motoneurons can be quantified to measure cell survival. Additionally, the motoneurons can be accurately captured using laser microdissection for molecular analysis. Because the facial nerve axotomy is minimally invasive and well tolerated, it can be utilized on a wide variety of genetically modified mice. Also, this surgery model can be used to analyze the effectiveness of peripheral nerve injury treatments. Facial nerve injury provides a means for investigating not only motoneurons, but also the responses of the central and peripheral glial microenvironment, immune system, and target musculature. The facial nerve injury model is a widely accepted peripheral nerve injury model that serves as a powerful tool for studying nerve injury and regeneration.

We present a surgical protocol detailing how to perform a cut or crush axotomy on the facial nerve in the mouse. The facial nerve axotomy can be employed to study the physiological response to nerve injury and test therapeutic techniques.

Axotomía nervio facial en ratones: un modelo para estudiar las motoneuronas respuesta a la lesión

The goal of this surgical protocol is to expose the facial nerve, which innervates the facial musculature, at its exit from the stylomastoid foramen and ...

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The "Wire-Injury" Model

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. Moreover, by rupture of the defective vascular wall, atherosclerosis induces occlusive thrombus formation, which represents the main cause of myocardial infarction or stroke and the most frequent cause of death. Despite the advances in the cardiovascular field, many questions remain unanswered, and additional basic research is essential to improve our understanding of the molecular mechanisms during atherosclerosis and its effects. Due to limited clinical studies, there is a need for representative animal models recreating atherosclerotic conditions such as neointima formation after stent implantation, balloon angioplasty, or endarterectomy. Since the mouse presents many advantages and is the most frequently used model for studying molecular processes, the current study proposes an invasive procedure of endothelial denudation, also known as the wire-injury model, which is representative of the human condition of neointima formation in arteries after revascularization procedures.

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The &quot;Wire-Injury&quot; Model

This study describes an invasive procedure for the induction of accelerated atherosclerosis in mice. In comparison to other methods using electric- or cryo-induced injury, mechanical-induced injury mimics the human condition of restenosis after revascularization therapies and is ideal for the study of the molecular mechanisms involved.

Inducción de la Aterosclerosis Acelerada en Ratones: El Modelo de "Lesiones por Alambre"

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. ...

Technique of Minimally Invasive Transverse Aortic Constriction in Mice for Induction of Left Ventricular Hypertrophy

Transverse aortic constriction (TAC) in mice is one of the most commonly used surgical techniques for experimental investigation of pressure overload-induced left ventricular hypertrophy (LVH) and its progression to heart failure. In the majority of the reported investigations, this procedure is performed with intubation and ventilation of the animal which renders it demanding and time-consuming and adds to the surgical burden to the animal. The aim of this protocol is to describe a simplified technique of minimally invasive TAC without intubation and ventilation of mice. Critical steps of the technique are emphasized in order to achieve low mortality and high efficiency in inducing LVH.
Male C57BL/6 mice (10-week-old, 25-30 g, n=60) were anesthetized with a single intraperitoneal injection of a mixture of ketamine and xylazine. In a spontaneously breathing animal following a 3-4 mm upper partial sternotomy, a segment of 6/0 silk suture threaded through the eye of a ligation aid was passed under the aortic arch and tied over a blunted 27-gauge needle. Sham-operated animals underwent the same surgical preparation but without aortic constriction. The efficacy of the procedure in inducing LVH is attested by a significant increase in the heart/body weight ratio. This ratio is obtained at days 3, 7, 14 and 28 after surgery (n = 6 - 10 in each group and each time point). Using our technique, LVH is observed in TAC compared to sham animals from day 7 through day 28. Operative and late (over 28 days) mortalities are both very low at 1.7%.
In conclusion, our cost-effective technique of minimally invasive TAC in mice carries very low operative and post-operative mortalities and is highly efficient in inducing LVH. It simplifies the operative procedure and reduces the strain put on the animal. It can be easily performed by following the critical steps described in this protocol.

The aim of this protocol is to describe step-by-step the technique of minimally invasive transverse aortic constriction (TAC) in mice. By elimination of intubation and ventilation which are mandatory for the commonly used standard procedure, minimally invasive TAC simplifies the operative procedure and reduces the strain put on the animal.

Técnica mínimamente invasiva constricción aórtica transversal en ratones para la inducción de la hipertrofia Ventricular izquierda

Transverse aortic constriction (TAC) in mice is one of the most commonly used surgical techniques for experimental investigation of pressure ...

A Minimally Invasive Model to Analyze Endochondral Fracture Healing in Mice Under Standardized Biomechanical Conditions

Bone healing models are necessary to analyze the complex mechanisms of fracture healing to improve clinical fracture treatment. During the last decade, an increased use of mouse models in orthopedic research was noted, most probably because mouse models offer a large number of genetically-modified strains and special antibodies for the analysis of molecular mechanisms of fracture healing. To control the biomechanical conditions, well-characterized osteosynthesis techniques are mandatory, also in mice. Here, we report on the design and use of a closed bone healing model to stabilize femur fractures in mice. The intramedullary screw, made of medical-grade stainless steel, provides through fracture compression an axial and rotational stability compared to the mostly used simple intramedullary pins, which show a complete lack of axial and rotational stability. The stability achieved by the intramedullary screw allows the analysis of endochondral healing. A large amount of callus tissue, received after stabilization with the screw, offers ideal conditions to harvest tissue for biochemical and molecular analyses. A further advantage of the use of the screw is the fact that the screw can be inserted into the femur with a minimally invasive technique without inducing damage to the soft tissue. In conclusion, the screw is a unique implant that can ideally be used in closed fracture healing models offering standardized biomechanical conditions.

This protocol describes a minimally invasive osteosynthesis technique using an intramedullary screw for standardized stabilization of femur fractures, which can be used to analyze endochondral bone healing in mice.

Un modelo mínimamente invasivo para analizar la fractura endocondral en ratones en condiciones biomecánicas estandarizadas

Bone healing models are necessary to analyze the complex mechanisms of fracture healing to improve clinical fracture treatment. During the last decade, an ...