Nuestro protocolo amplía el uso de G.mellonella de un modelo de infección sistémica a un modelo que permite la administración bacteriana a través de la vía oral natural. G.mellonella es un modelo de reemplazo adecuado para roedores en el análisis de diferentes señas de identidad de interacciones de micro-post innatos, ya que las larvas se pueden utilizar para bacterias patógenas humanas. Comience por transferir los huevos puestos por polillas adultas a cajas de dos litros que contienen sustrato de polilla de cera, a 30 grados Celsius, en la oscuridad.
Después de una a dos semanas, transfiera 25 gramos de larva que contenga sustrato a sustrato fresco, cuando la larva pequeña y diminuta se haga visible. Sincronizar las larvas después de dos semanas según su tamaño, en grupos de 30 a 40 larvas en nuevos recipientes de dos litros sobre sustrato de polilla de cera. Después de dos semanas, seleccione larvas para el experimento en peso.
Usando sólo larvas pálidas y de movimiento rápido con una masa de 180 a 200 miligramos. Para forzar el alimentación de las larvas, cargue una jeringa de insulina con una aguja de punta contundente para aplicación oral, con una de 10 a la séptima bacteria por cada 10 microlitros de DPBS por larva. Cargue la jeringa en una bomba de microsyringe.
Espere a que una larva abra las partes de la boca antes de insertar la jeringa cuidadosamente entre las mandíbulas y entregar las bacterias. Cuando todas las larvas hayan sido alimentadas, incubar los animales en la oscuridad a 37 grados centígrados, entre una y 24 horas. Para el procesamiento de larvas, limpie una capucha de seguridad con etanol y reactivo de pulverización para evitar la contaminación por RNase.
Congela la larva viva en nitrógeno líquido. Homogeneizar cada larva congelada individual usando un mortero y pestillo y un pequeño volumen de nitrógeno líquido. Cuando se haya producido un homogeneato en polvo, transfiera el homogeneato a un bote de espera desechable y espere a que el nitrógeno líquido se evapore.
Una vez homogeneizadas todas las larvas, mezcle los homogeneizados en polvo con un mililitro de TRIzol en un tubo de dos mililitros. Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante una hora. Al final de la incubación, pele el homogeneización por centrifugación.
Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo. Mezclar el sobrenadante con 200 microlitros de 1-Bromo-3-cloropropano, o BCP. Vórtice e incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente, seguido de una incubación de 10 minutos sobre hielo.
Al final de la segunda incubación, centrifuga la BCP agregó reacción y transfirió la capa transparente superior a un nuevo tubo de dos mililitros. Precipitar el ARN de la capa superior transferida con 500 microlitros de isopropanol mezclando e invirtiendo el tubo durante cinco minutos. A continuación, recoger el ARN precipitado por centrifugación.
Lavar el pellet de ARN precipitado con 500 microlitros de 75% etanol y secar el ARN durante cinco a 10 minutos a temperatura ambiente. Cuando el etanol se haya evaporado, agregue 100 microlitros de inhibidor de la ribonucleasa en agua libre de nucleasas al pellet de ARN seco, y vórtice cuidadosamente el tubo hasta que el pellet se disuelva por completo. Mida la calidad y la cantidad del ARN por protocolos estándar, asegurando que la relación 260 a 280 sea aproximadamente dos, y la relación 260 a 230 esté en el rango de dos a 2.2.
A continuación, utilice cinco microgramos del ARN aislado para la digestión de DNase y el análisis de expresión génica, de acuerdo con los protocolos estándar. G.mellonella es capaz de eliminar la carga bacteriana alimentada por la fuerza inicial hasta que no se detecten bacterias. Con el gen 16s, los números de copia genética de B.vulgatus y E.coli disminuyeron sustancialmente en 24 horas.
Commensal administró una G.mellonella larvas induce la expresión génica de ARN de varios genes marcadores de inmunidad innata. Por ejemplo, las moléculas de reconocimiento de LPS, la apolipoforina y la hemolina se expresan generalmente más altamente en las larvas administradas por E.coli en comparación con las larvas administradas por B.vulgatus. Además, la producción de especies reactivas de oxígeno y nitrógeno están fuertemente reguladas sobre la alimentación por fuerza de E.coli en comparación con B.vulgatus, así como la expresión genética antioxidante del GST.
Además, la expresión diferencial de péptido microbiano se induce con mayor fuerza después de la administración de E.coli que en respuesta a la alimentación por fuerza de B.vulgatus. Recuerde usar sólo larvas sanas, blancas y en movimiento rápido, para usar la paciencia durante la alimentación forzada para evitar el estrés de las larvas e incluir todos los controles necesarios. La activación de los marcadores inmunes de G.mellonella puede determinarse directamente mediante ensayos de actividad RUS o GST y la abundancia de ANP puede determinarse mediante ensayos de inhibición del crecimiento bacteriano.
Esta técnica se puede utilizar como una herramienta de cribado para bacterias commensales y patógenas y para explorar simbiomas intestinales y patobiomas sin sacrificio de muchos vertebrados. Utilice siempre el equipo de protección personal adecuado cuando trabaje con nitrógeno líquido, BCP o sustancias TRIzol.
