Наш протокол расширяет использование G.mellonella от системной модели инфекции до модели, которая позволяет бактериального введения через естественный устный маршрут. G.mellonella является подходящей моделью замены для грызунов при анализе различных признаков врожденных микро-пост взаимодействий, как личинки могут быть использованы для человека патогенных бактерий. Начните с передачи яиц, отложенных взрослыми ночными бабочками, в две литровые коробки, содержащие субстрат восковой моли, при 30 градусах по Цельсию, в темноте.
Через одну-две недели перенесите 25 граммов личинки, содержащей субстрат, в свежий субстрат, когда станут видны мелкие и крошечные личинки. Синхронизировать личинки через две недели в зависимости от их размера, в группы от 30 до 40 личинок в новых двухлитровых контейнерах на подложке восковой моли. Через две недели выберите личинки для эксперимента по весу.
Используя только бледные, быстро движущиеся личинки с массой от 180 до 200 миллиграммов. Чтобы заставить кормить личинок, загрузите инсулиновый шприц тупой иглой для перорального применения, с одним разом от 10 до седьмой бактерии на 10 микролитров DPBS на личинку. Загрузите шприц в микрохирург.
Подождите личинки, чтобы открыть его части рта, прежде чем вставить шприц тщательно между челюстями и доставки бактерий. Когда все личинки были поданы, инкубировать животных в темноте при 37 градусов по Цельсию, от одного до 24 часов. Для обработки личинок очистите защитный капот этанолом и реагентом для предотвращения загрязнения RNase.
Привязать заморозить живую личинку в жидком азоте. Гомогенизировать каждый отдельный замороженных личинок с помощью раствора и пестика и небольшой объем жидкого азота. Когда порошкообразный гомогенат был произведен, перенесите гомогенат в одноразовую лодку ожидания и подождите, пока жидкий азот испарится.
Когда все личинки были гомогенизированы, смешать порошкообразных гомогенатов с одним миллилитром TRIzol в двух миллилитровой трубки. Инкубировать смесь при комнатной температуре в течение одного часа. В конце инкубации гранулы гомогената центрифугации.
Перенесите супернатант в новую трубку. Смешайте супернатант с 200 микролитров 1-Бромо-3-хлоропропан, или BCP. Вихрь и инкубацию в течение пяти минут при комнатной температуре, а затем 10 минут инкубации на льду.
В конце второй инкубации центрифуга BCP добавила реакцию и перенести верхний прозрачный слой в новую, двухмилитровую трубку. Осадок РНК переданного верхнего слоя с 500 микролитров изопропанола путем смешивания и инвертирования трубки в течение пяти минут. Затем соберите осаждаемую РНК путем центрифугации.
Вымойте осажденные гранулы РНК с 500 микролитров 75% этанола и высушить РНК в течение пяти-десяти минут при комнатной температуре. Когда этанол испарится, добавьте 100 микролитров ингибитора рибонуклеазы в воду без нуклеазы в высушенные гранулы РНК и тщательно вихрем трубки, пока гранулы полностью не растворяются. Измерьте качество и количество РНК по стандартным протоколам, гарантируя, что соотношение 260 к 280 составляет примерно два, а соотношение 260 к 230 находится в диапазоне от двух до 2,2.
Затем используйте пять микрограммов изолированной РНК для пищеварения DNase и анализа экспрессии генов, в соответствии со стандартными протоколами. G.mellonella способен очистить начальную силу кормили бактериальной нагрузки, пока бактерии не обнаруживаются. С 16s количество копий генов как B.vulgatus и E.coli существенно сократилось в течение 24 часов.
Commensal вводили личинки G.mellonella индуцировать экспрессию гена РНК различных врожденных генов маркера иммунитета. Например, молекулы распознавания LPS, аполипофорин и гемолин, как правило, выражены более высоко в личинках E.coli по сравнению с личинками B.vulgatus. Кроме того, производство реактивного кислорода и азота сильно регулируется на E.coli силы кормления по сравнению с B.vulgatus, а также антиоксидантной экспрессии генов GST.
Кроме того, дифференциальная экспрессия микробного пептида индуцируется сильнее после введения E.coli, чем в ответ на силовое кормление B.vulgatus. Не забудьте использовать только здоровые, белые, быстро движущиеся личинки, чтобы использовать терпение во время силового кормления, чтобы избежать стресса личинок и включить все необходимые элементы управления. Активация иммунных маркеров G.mellonella может быть определена непосредственно анализами активности RUS или GST, а обилие ANPs может быть определено с помощью анализа ингибирования роста бактерий.
Этот метод может быть использован в качестве инструмента скрининга для commensal и патогенных бактерий и для изучения кишечных симбиомов и патобиомов без жертв многих позвоночных. Всегда используйте соответствующее средства индивидуальной защиты при работе с жидким азотом, BCP или веществами TRIzol.
