우리의 프로토콜은 전신 감염 모델에서 천연 구강 경로를 통해 세균 투여를 허용하는 모델로 G.mellonella의 사용을 확장합니다. G.mellonella는 유충이 인간 병원성 박테리아에 사용될 수 있기 때문에 타고난 마이크로 포스트 상호 작용의 다른 특징을 분석하는 설치류를 위한 적합한 대체 모델입니다. 먼저 성인 나방이 낳은 알을 어둠 속에서 섭씨 30도에서 왁스 나방 기판이 들어있는 두 리터 상자로 옮기는 것으로 시작합니다.
1 ~ 2 주 후에, 작고 작은 애벌레가 눈에 띄게 될 때, 신선한 기판으로 기판을 포함하는 애벌레의 25 그램을 전송합니다. 그들의 크기에 따라 2 주 후에 애벌레를 동기화, 왁스 나방 기판에 새로운 두 리터 용기에 30 ~ 40 애벌레의 그룹으로. 2 주 후, 무게에 의해 실험에 대 한 애벌레를 선택 합니다.
180~200밀리그램의 질량을 가진 창백하고 빠르게 움직이는 애벌레만 사용하십시오. 애벌레를 강제로 먹이려면, 경구 용 무딘 바늘로 인슐린 주사기를 적재하고, 애벌레 당 DPBS의 10 마이크로 리터 당 일곱 번째 박테리아에 1회 10을 로드합니다. 주사기를 미세 주사기 펌프에 적재합니다.
하악골 사이에 주사기를 조심스럽게 삽입하고 박테리아를 전달하기 전에 유충이 입 부분을 열 때까지 기다립니다. 모든 애벌레가 먹이를 주었을 때, 어둠 속에서 동물을 섭씨 37도에서 1~24시간 사이 배양하십시오. 유충 가공의 경우 RNase 오염을 방지하기 위해 에탄올과 스프레이 시약으로 안전 후드를 청소하십시오.
스냅 액체 질소에 살아있는 애벌레를 동결. 박격포와 유봉및 소량의 액체 질소를 사용하여 각 개별 냉동 유충을 균질화합니다. 분말 균주가 생성되면, 일회용 대기 보트로 균류를 전송하고 액체 질소가 증발 할 때까지 기다립니다.
모든 애벌레가 균질화되었을 때, 2 밀리리터 튜브에 TRIzol의 1 밀리리터와 분말 균질화를 혼합합니다. 1 시간 동안 실온에서 혼합물을 배양. 인큐베이션의 끝에서, 원심 분리에 의해 균동화 펠릿.
상체를 새 튜브로 옮기습니다. 1-브로모-3-클로로프로판 또는 BCP의 200 마이크로리터와 상수체를 섞는다. 소용돌이와 실내 온도에서 5 분 동안 배양하고 얼음에 10 분 배양.
두 번째 인큐베이션의 끝에서, 원심분리기 BCP는 반응을 추가하고 새로운, 두 밀리리터 튜브로 상부 투명 층을 전송. 5분 동안 튜브를 혼합하고 반전시킴으로써 500마이크로리터의 이소프로판올을 통해 이송된 상층의 RNA를 침전시한다. 그런 다음 원심분리에 의해 침전RNA를 수집한다.
침전된 RNA 펠릿을 75%에탄올의 500마이크로리터로 세척하고 실온에서 5~10분 동안 RNA를 건조시하십시오. 에탄올이 증발하면, 말린 RNA 펠릿에 뉴클레아제없는 물에 100 마이크로리터를 추가하고 펠릿이 완전히 용해 될 때까지 튜브를 조심스럽게 소용돌이시킵니다. 표준 프로토콜에 의한 RNA 품질 및 수량을 측정하여 260 대 280 비율이 약 2이고 260 대 230 비율은 2~ 2.2의 범위에 있습니다.
그런 다음 표준 프로토콜에 따라 DNase 소화 및 유전자 발현 분석을 위해 절연 된 RNA의 5 마이크로 그램을 사용합니다. G.mellonella는 박테리아가 검출될 수 없을 때까지 세균 부하를 공급하는 초기 힘을 지울 수 있습니다. B.vulgatus와 E.coli 둘 다의 16s 유전자 복사 수로 실질적으로 24 시간 안에 감소했습니다.
G.mellonella 애벌레를 투여한 Commensal은 다양한 선천성 면역 마커 유전자의 RNA 유전자 발현을 유도한다. 예를 들어, LPS 인식 분자, 아폴리포포린 및 헤몰린은 일반적으로 B.vulgatus 투여애벌레에 비해 대장균 투여 애벌레에서 더 높게 발현된다. 또한, 반응성 산소 및 질소 종의 생산은 B.vulgatus뿐만 아니라 항산화 GST 유전자 발현에 비해 대장균력 공급에 강하게 강화된다.
또한, 차동 미생물 펩티드 발현은 B.vulgatus 힘 공급에 반응하는 것보다 대장균 투여 후 더 강하게 유도된다. 건강하고 흰색이며 빠르게 움직이는 애벌레만 사용하여 유충을 강조하는 것을 피하고 필요한 모든 컨트롤을 포함하기 위해 힘 먹이 기 동안 인내심을 사용해야합니다. G.mellonella 면역 마커의 활성화는 RUS 또는 GST 활성 작용체에 의해 직접 결정될 수 있으며 ANP의 풍부는 세균 성장 억제 작용에 의해 결정될 수 있다.
이 기술은 근생 및 병원성 박테리아를 위한 검열 공구로 이용되고 많은 척추동물의 희생 없이 장 공생및 병원체를 탐구하기 위한 것입니다. 액체 질소, BCP 또는 TRIzol 물질로 작업 할 때 항상 적절한 개인 보호 장비를 사용합니다.
