Protokolümüz G.mellonella kullanımını sistemik enfeksiyon modelinden doğal oral yol ile bakteriyel uygulama sağlayan bir modele genişletir. G.mellonella larvalar insan patojenik bakteriler için kullanılabilir gibi doğuştan gelen mikro-post etkileşimleri farklı işaretleri analiz kemirgenler için uygun bir yedek modeldir. Yetişkin güveler tarafından döşenen yumurtaları karanlıkta 30 derecede balmumu güve substratı içeren iki litrelik kutulara aktararak başlayın.
1-2 hafta sonra, küçük ve küçük larva görünür hale geldiğinde, taze substrat içine substrat içeren larva 25 gram aktarın. Larvaları boyutlarına göre iki hafta sonra, balmumu güve substratı üzerinde yeni iki litrelik kaplarda 30-40 larva gruplarına senkronize edin. İki hafta sonra, kiloya göre deney için larvaları seçin.
180 ila 200 miligram lık bir kütleye sahip sadece soluk, hızlı hareket eden larvalar kullanıyor. Larvaları beslemeye zorlamak için, insülin şırıngasını oral uygulama için künt uçlu bir iğneyle yükleyin, larva başına 10 mikrolitrede 10'dan 7'sine kadar. Şırıngayı bir mikroşun pompasına yükleyin.
Bir larva mandibulalar arasında dikkatlice eklemeve bakteri teslim önce ağız parçaları açmak için bekleyin. Tüm larvalar beslendiğinde, karanlıktaki hayvanları 37 derecede, 1 ila 24 saat arasında kuluçkaya yatırın. Larva işleme için, RNase kontaminasyonunu önlemek için bir güvenlik başlığını etanol ve sprey reaktifi ile temizleyin.
Canlı larvayı sıvı nitrojende dondurun. Bir harç ve havaneli ve sıvı azot küçük bir hacim kullanarak her bir dondurulmuş larva homojenize. Bir toz homojen üretildiğinde, homojeni tek kullanımlık bir bekleme teknesine aktarın ve sıvı nitrojenin buharlaşmasını bekleyin.
Tüm larvahomojenize edildiğinde, toz homojenleri bir mililitre TRIzol ile iki mililitrelik bir tüpe karıştırın. Karışımı oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatırın. Kuluçka sonunda, santrifüj ile homogenate pelet.
Supernatant'ı yeni bir tüpe aktarın. 1-Bromo-3-kloropropan veya BCP 200 mikrolitre ile supernatant karıştırın. Girdap ve oda sıcaklığında beş dakika kuluçka, buz üzerinde 10 dakikalık kuluçka takip.
İkinci kuluçka sonunda, BCP santrifüj reaksiyon ekledi ve yeni bir üst şeffaf tabaka transfer, iki mililitrelik tüp. Tüpü beş dakika karıştırıp ters çevirerek 500 mikrolitre izopropanol ile aktarılan üst katmanın RNA'sını çökeltin. Sonra santrifüj ile çökelti RNA toplamak.
Çökelmiş RNA peletini %75 etanol500 mikrolitre ile yıkayın ve Oda sıcaklığında 5 ila 10 dakika boyunca RNA kurulayın. Etanol buharlaştığında, kurutulmuş RNA peletine çekirdeksiz suya 100 mikrolitre ribonükleaz inhibitörü ekleyin ve pelet tamamen eriyene kadar tüpü dikkatlice girdaplayın. RNA kalitesini ve miktarını standart protokollere göre ölçün, 260-280 oranının yaklaşık iki, 260-230 oranının ise iki ila 2,2 aralığında olmasını sağlar.
Daha sonra standart protokollere göre, DNase sindirim ve gen ekspresyonu analizi için izole RNA beş mikrogram kullanın. G.mellonella hiçbir bakteri tespit edilene kadar ilk kuvvet bakteri yükü beslenen temizlemek mümkün. B.vulgatus ve E.coli'nin 16'lı gen kopya sayıları 24 saat içinde önemli ölçüde azaldı.
Commensal çeşitli doğuştan gelen bağışıklık belirteç genlerinin RNA gen ekspresyonunu indüklenen g.mellonella larvaları uyguladı. Örneğin, LPS tanıma molekülleri, apolipophorin ve hemolin genellikle Daha yüksek E.coli uygulanan larvalar b.vulgatus uygulanan larvalar ile karşılaştırıldığında daha yüksek ifade edilir. Ayrıca, reaktif oksijen ve azot türlerinin üretimi, B.vulgatus'a göre E.coli kuvvet beslemesi ve antioksidatif GST gen ekspresyonu ile güçlü bir şekilde düzenlenir.
Buna ek olarak, diferansiyel mikrobiyal peptit ekspresyonu B.vulgatus kuvvet beslemeyanıt daha E.coli uygulamasından sonra daha güçlü indüklenir. Larvaları strese sokmamak ve gerekli tüm kontrolleri dahil etmek için kuvvet besleme sırasında sabır kullanmak için sadece sağlıklı, beyaz, hızlı hareket eden larvaları kullanmayı unutmayın. G.mellonella immün belirteçlerinin aktivasyonu doğrudan RUS veya GST aktivitesi tahlilleri ile belirlenebilir ve ANP bolluğu bakteriyel büyüme inhibisyonu tahlilleri ile belirlenebilir.
Bu teknik kommensal ve patojenik bakteriler için bir tarama aracı olarak ve birçok omurgalı kurban olmadan bağırsak simbiyomları ve patobiyomlar keşfetmek için kullanılabilir. Sıvı nitrojen, BCP veya TRIzol maddelerle çalışırken her zaman uygun kişisel koruyucu ekipmanı kullanın.
